用于使用封闭的2-AA进行聚糖分析的方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供在标记聚糖以供分析的程序中使用以叔丁氧羰基(“Boc”)基团封闭的邻氨基苯甲酸(2‑AA)的方法，以及提供2‑AA‑Boc和用于使封闭的2‑AA解封闭的酸、用于聚糖标记和分析的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于使用封闭的2-AA进行聚糖分析的方法和试剂盒相关申请的交叉引用此申请要求2018年2月2日提交的美国临时专利申请号62/625,846的优先权和权益，将其内容通过提述并入本申请以用于所有目的。联邦资助声明不适用。专利技术背景确定生物样品的聚糖(glycan)特征在很多情况下已经具有重要性。例如，需要确定糖蛋白诸如抗体治疗剂的聚糖特征，以确保一致的生物学特性。此外，此类治疗剂的生产过程中需要监测糖基化谱，以防止可能不利地影响该药剂的产量或特性的发酵条件变化。已经开发了多种标记物，这样的标记物上附接的聚糖可以通过分析来检测，例如通过观察标记的聚糖的荧光对标记的聚糖进行质谱分析。糖蛋白上存在的N-聚糖经常通过以下方式进行分析：用PNGaseF酶从糖蛋白释放出N-聚糖，并用试剂(诸如共有的美国专利号8,124,792和8,445,292中教导的试剂)标记所得的葡基胺。标记聚糖的另一种方式是使用2-氨基苯甲酰胺(“2-AB”)或邻氨基苯甲酸(“2-AA”)等荧光染料将它们还原性胺化。参见，例如，Bigge等,“NonselectiveandEfficientFluorescentLabelingofGlycansUsing2-AminoBenzamideandAnthranilicAcid,”Anal.Biochem.230:229-238(1995)。随后一般通过例如高效液相色谱法(“HPLC”)或毛细管电泳来分离出标记的聚糖，然后提供给分析装置，诸如荧光检测器。尽管2-AB仍广泛用于通过还原性胺化来标记聚糖，但至少在美国，由于管制物质法案(ControlledSubstancesAct.)21U.S.C.§§801等等施加的限制，将2-AA用于这些目的变得更加困难。该法案第802(34)节将邻氨基苯甲酸、其酯类及其盐列为用于制备管制物质的“第1清单化学制品”。第1清单化学制品要遵守关于记录保存、分发和运输的各种要求。2-AA被认为标记聚糖的敏感性比2-AB稍高。如果有一种方便的方式以适合于聚糖分析的形式提供2-AA，但遵守药品监督局(DrugEnforcementAdministration，“DEA”)关于邻氨基苯甲酸、其酯和其盐的规则，将是令人期望的。对于使2-AA可用于聚糖的还原性胺化和标记，同时仍遵守控制2-AA、其酯和其盐的分布和运输的DEA法规的方法和试剂盒仍有需求。令人惊讶地，本专利技术以被认为可以满足这些和其它需求。专利技术概述在一些实施方案中，本专利技术提供用邻氨基苯甲酸(“2-AA”)标记聚糖的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：获得与叔丁氧羰基(“Boc”)基团缀合的2-AA(“2-AA-Boc”)，通过在足以从所述2-AA-Boc中去除Boc基团的时间和温度下将所述2-AA-Boc与酸一起温育来去除所述Boc基团，由此获得2-AA，以及在允许2-AA标记聚糖的条件下温育含有2-AA和聚糖的溶液，由此用2-AA标记聚糖。在一些实施方案中，所述酸是三氟乙酸、二氟乙酸或盐酸。在一些实施方案中，所述酸是二氟乙酸(“DFA”)。在一些实施方案中，所述足以从2-AA-Boc中去除Boc基团的温度为50-90℃。在一些实施方案中，所述足以从2-AA-Boc中去除Boc基团的温度为约70℃。在一些实施方案中，所述足以从2-AA-Boc中去除Boc基团的时间为约1小时至过夜。在一些实施方案中，与所述2-AA-Boc一起温育的酸是无溶剂(neat)的。在一些实施方案中，与所述2-AA-Boc一起温育的酸在非质子、有机溶剂中。在一些实施方案中，所述非质子、有机溶剂是二甲基亚砜(“DMSO”)、二甲基甲酰胺(“DMF”)或N-甲基甲酰胺。在一些实施方案中，所述非质子、有机溶剂是二甲基亚砜。在一些实施方案中，所述酸以1M至6M的浓度存在。在一些实施方案中，所述酸是DFA且以约4M的浓度存在。在一些实施方案中，所述酸在水溶液中，且所述方法进一步包括在将所述酸与所述2-AA-Boc温育后干燥所述2-AA，以在将所述2-AA与聚糖温育之前去除所述水溶液。在一些实施方案中，所述2-AA与聚糖的温育是在约50-90℃下。在一些实施方案中，所述2-AA与所述聚糖的温育是在约65℃下。在一些实施方案中，所述2-AA的溶液和所述聚糖进一步包含还原剂。在一些实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠或甲基吡啶硼烷。在第二组实施方案中，本专利技术提供通过还原性胺化用邻氨基苯甲酸(“2-AA”)标记聚糖的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含：含有与叔丁氧羰基(“Boc”)基团缀合的2-AA(“2-AA-Boc”)的容器，和含有适用于从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团的酸的容器，所述酸的浓度足以从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团。在一些实施方案中，所述适用于从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团的酸适用于在无水条件下去除所述Boc基团。在一些实施方案中，所述酸是三氟乙酸、二氟乙酸或盐酸。在一些实施方案中，所述酸是二氟乙酸。在一些实施方案中，所述二氟乙酸是无溶剂的。在一些实施方案中，所述酸在非质子、有机溶剂中。在一些实施方案中，所述非质子、有机溶剂是二甲基亚砜(“DMSO”)、二甲基甲酰胺(“DMF”)或N-甲基甲酰胺。在一些实施方案中，所述非质子、有机溶剂是DMSO。在一些实施方案中，所述酸以1M至6M的浓度存在于所述非质子、有机溶剂中。在一些实施方案中，所述酸以约4M的浓度存在于所述非质子、有机溶剂中。在一些实施方案中，所述2-AA-Boc的量为5-10mg。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含还原剂。在一些实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠。在一些实施方案中，所述还原剂是甲基吡啶硼烷。在一些实施方案中，所述还原剂溶解在有机溶剂中。在一些实施方案中，所述溶剂是DMSO。专利技术详述还原性胺化是标记聚糖以进行分析的常用方法。两种荧光团——邻氨基苯甲酸(2-氨基苯甲酸，又称“2-AA”)，和2-氨基苯甲酰胺，又称“2-AB”——由于附接于聚糖的稳定性和敏感性而被广泛用于通过还原性胺化来标记聚糖。根据Sigma-Aldrich网站，2-AA标记聚糖的敏感性比2-AB稍高。不幸的是，如“专利技术背景”中所述，美国药品监督局(“DEA”)对邻氨基苯甲酸、其酯类及其盐类的使用施加了限制和保存记录的要求，因为它们也可用于合成管制物质安眠酮。这些限制使得在美国更加难以将2-AA用于聚糖标记和分析的合法用途。令人惊讶地，本专利技术提供了标记聚糖以用于分析的试剂盒和方法，这些试剂盒和方法允许运输和使用2-AA的衍生物，其不是邻氨基苯甲酸，也不是邻氨基苯甲酸的酯或盐，但只需对标记聚糖的标准工作流程稍微修改，就可以允许引入和使用该衍生物用于标记聚糖。本专利技术的试剂盒和方法采用氨基被叔丁氧羰基(“Boc”)基团保护的2-AA。在肽合成过程中，在有机合成中使用Boc基团保护氨基是众所周知的。通常，添加Boc保护基，进行期望的合成步骤，并通过将带有Boc基团的化合物与酸一起温育来去除该保护基。取决于酸，温育可以在环境本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用邻氨基苯甲酸(“2-AA”)标记聚糖的方法，所述方法包括：(a)获得与叔丁氧羰基(“Boc”)基团缀合的2-AA(“2-AA-Boc”)，/n(b)通过在足以从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团的时间和温度下将所述2-AA-Boc与酸一起温育来去除所述Boc基团，由此获得2-AA，以及/n(c)在允许所述2-AA标记所述聚糖的条件下温育含有所述2-AA的溶液和所述聚糖，由此用2-AA标记所述聚糖。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180202 US 62/625,8461.一种用邻氨基苯甲酸(“2-AA”)标记聚糖的方法，所述方法包括：(a)获得与叔丁氧羰基(“Boc”)基团缀合的2-AA(“2-AA-Boc”)，
(b)通过在足以从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团的时间和温度下将所述2-AA-Boc与酸一起温育来去除所述Boc基团，由此获得2-AA，以及
(c)在允许所述2-AA标记所述聚糖的条件下温育含有所述2-AA的溶液和所述聚糖，由此用2-AA标记所述聚糖。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸是三氟乙酸、二氟乙酸或盐酸。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述酸是二氟乙酸(“DFA”)。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述足以从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团的温度为50-90℃。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述足以从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团的温度为约70℃。


6.根据权利要求1所述的方法，其中所述足以从所述2-AA-Boc中除去所述Boc基团的时间为约1小时至过夜。


7.根据权利要求1所述的方法，其中与所述2-AA-Boc一起温育的所述酸是无溶剂的。


8.根据权利要求1所述的方法，其中与所述2-AA-Boc一起温育的所述酸在非质子、有机溶剂中。


9.根据权利要求8所述的方法，其中所述非质子、有机溶剂是二甲基亚砜(“DMSO”)、二甲基甲酰胺(“DMF”)或N-甲基甲酰胺。


10.根据权利要求9所述的方法，其中所述非质子、有机溶剂是二甲基亚砜。


11.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸以1M至6M的浓度存在。


12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酸是DFA且以约4M的浓度存在。


13.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸在水溶液中，且所述方法在所述步骤(b)和(c)之间进一步包括步骤(b’)，干燥所述2-AA以去除所述水溶液。


14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)的所述温育是在约50-90℃下。


15.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)的所述温育是在...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·弗拉森科，F·T·哈克，N·A·格雷罗，
申请(专利权)人：安捷伦科技有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US