晚期效应T细胞亚群在制备辅助评估再生障碍性贫血病情程度试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术公开了晚期效应T细胞亚群在制备辅助评估再生障碍性贫血病情程度试剂盒中的应用。本发明专利技术发明专利技术人首次发现AA患者外周血中CD4

Application of late effector T cell subsets in the preparation of the kit for evaluating the severity of aplastic anemia

【技术实现步骤摘要】
晚期效应T细胞亚群在制备辅助评估再生障碍性贫血病情程度试剂盒中的应用
本专利技术属于生物医学领域，特别涉及一种晚期效应T细胞亚群在制备辅助评估再生障碍性贫血病情程度试剂盒中的应用。
技术介绍
再生障碍性贫血(aplasticanemia，AA)是一种以骨髓造血细胞增生减低和全血细胞减少为主要特征的血液系统疾病。我国AA的年发病率远远高于欧美，目前AA的临床诊断标准主要依据患者的外周血常规检查、多部位骨髓穿刺涂片分析、骨髓活检以及排除先天性和全血细胞减少和骨髓低增生的其他疾病等基础上进行诊断，并依据骨髓细胞增生程度和血常规检查将AA分为非重型再生障碍性贫血(Non-severeaplasticanemia，NSAA)，重型再生障碍性贫血(Severeaplasticanemia，SAA)和极重型再生障碍性贫血(Severeaplasticanemia，VSAA)。临床上，SAA和VSAA患者起病急，若无法得到有效治疗死亡率较高，病情程度较重AA患者(SAA和VSAA)的治疗策略选择也是和NSAA有不同，免疫抑制治疗是老年AA、NSAA和无合适供者年轻AA患者的首选治疗手段。同时，一部分难治和复发SAA和VSAA的临床治疗效果欠佳、免疫抑制剂治疗后所引起的副作用等问题也函待解决。目前，AA是一种T细胞功能异常影响骨髓造血功能的自身免疫性疾病，其中T细胞免疫失衡在AA发生发展中的作用得到认可。《再生障碍性贫血诊断与治疗中国专家共识》2017年版中特别强调了AA患者免疫指标的检测，便于辅助临床医师进行AA的诊断与鉴别诊断，这说明有关AA患者特征性免疫异常指标将逐步开展并应用于临床工作中。尽管有关AA中异常T细胞免疫的研究很多，但是不同病情程度AA患者T细胞免疫异常是否存在特征性改变及其可能作用机制鲜有报道。前期发现NSAA患者中TCR信号通路中重要的信号分子CD3ζ的mRNA水平高于SAA患者，提示我们全面了解AA患者，尤其是不同病情程度AA患者T细胞免疫特点的异同，为今后临床医师对不同病情程度AA患者T细胞免疫异常认知的深入，及其在辅助诊断AA等方面而言，具有很好的研究意义和应用前景。近年随着对T细胞异质性认识的深入和相关检测技术手段发展，有关AA患者中T细胞微小亚群与AA发病、临床症状和免疫抑制治疗疗效之间关系的研究也成为该领域研究热点。我们前期研究也发现不同T细胞微小亚群在AA中的特征性改变，比如与AA病情程度相关的CD8+CD45RO-CD27-T细胞。鉴于目前临床诊断AA中对免疫指标的重视，以及目前尚无有关辅助诊断不同病情程度的免疫相关指标。因此，通过分析AA中不同T细胞微小亚群的分布和功能特点，及其临床意义是非常有必要的。初始T细胞识别外界抗原后，T细胞活化，分化、增殖并发挥T细胞的多种效应功能。根据不同T细胞膜表面相关分子的序贯表达变化特点，将整个T细胞活化/分化进程分为不同阶段，其中表型为CD45RO+CD27-的T细胞定义为晚期效应T细胞(LatedifferentiatedeffectTcells，LD)。晚期效应T细胞有其独特的生物学作用，在一些自身免疫性疾病中也发现该阶段T细胞与疾病有一定的关系。目前，尚未见AA患者中晚期效应T细胞特征性改变的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于弥补现有技术的缺点与不足，提供晚期效应T细胞亚群在制备辅助评估再生障碍性贫血病情程度试剂盒中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种辅助评估再生障碍性贫血病情程度的试剂盒。本专利技术的再一目的在于提供上述试剂盒的应用。本专利技术的目的通过下列技术方案实现：一种晚期效应T细胞在制备辅助评估再生障碍性贫血病情程度试剂盒中的应用，其中，所述的晚期效应T细胞是CD4+CD45RO+CD27-T细胞。本专利技术是基于本专利技术人首次发现AA患者外周血中CD4+CD45RO+CD27-T细胞亚群在病情轻重程度不同AA患者中特征性改变特点，所做出的专利技术创造。当所述的CD4+CD45RO+CD27-T细胞在CD4+T细胞中所占比例的中位数为9.69％，提示诊断为NSAA的可能性较大。当所述的CD4+CD45RO+CD27-T细胞在CD4+T细胞中所占比例的中位数为7.26％，提示诊断为SAA的可能性较大。当所述的CD4+CD45RO+CD27-T细胞在CD4+T细胞中所占比例的中位数为5.21％，提示诊断为VSAA的可能性较大。一种辅助评估再生障碍性贫血病情程度的试剂盒，包括如下检测CD4+CD45RO+CD27-T细胞的不同的荧光标记的单克隆抗体：抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD45RO抗体和抗CD27抗体。所述的抗CD3抗体的荧光标记优选为FITC。所述的抗CD4抗体的荧光标记优选为APC-H7。所述的抗CD45RO抗体的荧光标记优选为BV510。所述的抗CD27抗体的荧光标记优选为PE-Cy7。所述的试剂盒还包括用于裂解外周血红细胞的红细胞裂解液、细胞染色缓冲液和磷酸盐缓冲溶液(PBS)。上述试剂盒在非疾病诊断或治疗目的的检测CD4+CD45RO+CD27-T细胞中的应用，包括如下步骤：(1)处理待测外周血样本，形成单细胞悬液；(2)在步骤(1)得到的单细胞悬液中加入标记不同荧光的单克隆抗体：抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD45RO抗体和抗CD27抗体，轻轻混匀后避光孵育；(3)洗涤细胞后加入PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测，获得荧光标记后的CD4+CD45RO+CD27-T细胞的数据。步骤(1)中所述的处理待测外周血样本的步骤如下：将待测外周血样本依据常规方法进行全血红细胞裂解处理，离心去上清，洗涤，并用细胞染色缓冲液重悬得到单细胞悬液。所述的待测外周血样本的体积优选为200μL。所述的全血红细胞裂解处理优选为采用红细胞裂解液处理；裂解期间吹打混匀一次。所述的红细胞裂解液的用量优选为按其与所述的待检测外周血样本＝0.5～1.5:10(体积比)配比计算；更优选为与所述的待检测外周血样本＝1:10配比计算。所述的离心的相对离心力优选为100～300g；更优选为200g。所述的离心的时间优选为3～6min；更优选为5min。所述的洗涤为使用磷酸盐缓冲溶液进行洗涤。所述的磷酸盐缓冲溶液优选为pH值为7.2～7.4、浓度为0.01～0.1M的磷酸盐缓冲溶液；更优选为pH值为7.4、浓度为0.01M的磷酸盐缓冲溶液。所述的细胞染色缓冲液的用量优选为按其与所述的待检测外周血样本＝体积比1:1.5～2.5配比计算；更优选为与所述的待检测外周血样本＝1:2配比计算。步骤(2)中所述的抗CD3抗体的加入量优选按每100μL的单细胞悬液配比3～6μL抗CD3抗体计算；进一步优选为按每100μL单细胞悬液配比5μL抗CD3抗体计算。所述的抗CD3抗体的荧光标记优选为FITC；其浓度优选为200μg/mL。步骤(2)中所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.晚期效应T细胞亚群在制备辅助评估再生障碍性贫血病情程度试剂盒中的应用，其特征在于：所述的晚期效应T细胞亚群是CD4

【技术特征摘要】
1.晚期效应T细胞亚群在制备辅助评估再生障碍性贫血病情程度试剂盒中的应用，其特征在于：所述的晚期效应T细胞亚群是CD4+CD45RO+CD27-T细胞亚群。


2.一种辅助评估再生障碍性贫血病情程度的试剂盒，其特征在于：包括如下检测CD4+CD45RO+CD27-T细胞亚群的不同的荧光标记的单克隆抗体：抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD45RO抗体和抗CD27抗体。


3.根据权利要求2所述的辅助评估再生障碍性贫血病情程度的试剂盒，其特征在于：
所述的抗CD3抗体的荧光标记为FITC；
所述的抗CD4抗体的荧光标记为APC-H7；
所述的抗CD45RO抗体的荧光标记为BV510；
所述的抗CD27抗体的荧光标记为PE-Cy7。


4.根据权利要求2所述的辅助评估再生障碍性贫血病情程度的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括用于裂解外周血红细胞的红细胞裂解液、细胞染色缓冲液和磷酸盐缓冲溶液中的至少一种。


5.权利要求2～4任一项所述的试剂盒在非疾病诊断或治疗目的的检测CD4+CD45RO+CD27-T细胞中的应用。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于包括如下步骤：
(1)处理待测外周血样本，形成单细胞悬液；
(2)在步骤(1)得到的单细胞悬液中加入标记不同荧光的单克隆抗体：抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD45RO抗体和抗CD27抗体，轻轻混匀后避光孵育；
(3)洗涤细胞后加入PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测，获得荧光标记后的CD4+CD45RO+CD27-T细胞的数据。


7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
所述的抗CD3抗体的荧光标记为FITC；
所述的抗CD4抗体的荧光标记为APC-H7；
所述的抗CD45RO抗体的荧光标记为BV510；
所述的抗CD27抗体的荧光标记为PE-Cy7。


8.根据权利要求6所述的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：李萡，张玉平，李扬秋，黄桂璇，郁志，王顺清，陈小惠，周铭，黎宇苗，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44