牛支原体分泌蛋白MbovP280的应用制造技术

本发明专利技术公开了牛支原体分泌蛋白MbovP280在制备牛支原体诊断试剂、药物或疫苗中的应用，属于动物传染病防治技术领域。所述牛支原体分泌蛋白MbovP280具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，试验证明，牛支原体分泌蛋白MbovP280具有诱导宿主巨噬细胞活力下降和凋亡的能力，在研发新药和疫苗方面具有重要潜力。

【技术实现步骤摘要】
牛支原体分泌蛋白MbovP280的应用
本专利技术属于动物传染病防治
，具体涉及到一种牛支原体分泌蛋白MbovP280的应用，该蛋白具有诱导宿主巨噬细胞活力下降和凋亡的能力。
技术介绍
牛支原体(Mycoplasmabovis,M.bovis)属于古柔膜体纲(Mollicutes)，支原体目(Mycoplasmatles)，支原体科，支原体属，是一种能在体外复制的最小病原微生物。牛支原体可以感染任何年龄的牛，2～6月龄的犊牛最易感(Stipkovitsetal2000)，肉牛发病后临床症状主要表现为肺炎、关节炎，奶牛主要表现为乳房炎。牛支原体感染犊牛后往往难以治愈，与机体免疫系统对抗平衡后转成慢性病。当牛支原体病发生后，又会导致机体的免疫力下降，其他条件致病菌如A型多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌、呼吸道合胞体病毒等会乘机感染宿主加重临床症状，协同导致牛呼吸疾病综合征(Bovinerespiratorydiseases,BRD)(Radellieetal2008)。自从牛支原体从患乳房炎的乳汁中分离到后(Haleetal1962)，牛支原体在世界范围内广泛流行。2008年，在湖北省从外地引进的肉牛中爆发呼吸道疾病，牛群引进后2周左右发病，表现为发热，咳嗽，流鼻涕，犊牛和体质弱的牛发病严重。华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室通过病原分离鉴定，率先在全国确定该病为“传染性牛支原体肺炎”。此后牛支原体肺炎呈全国性流行，主要发生在新引入的育肥牛中，一般在引入后10～15天左右发病，发病率为80％以上。该病临床治疗效果差，死亡率高，平均死亡率为10％，最高可达到60％(石磊等，2008)。细胞凋亡也称为程序性细胞死亡，宿主细胞用来维持正常的细胞更替、胚胎发育和限制病原体的生存和繁殖。目前关于牛支原体诱导宿主巨噬细胞凋亡的机制研究还不清楚，而这一生物学过程对于牛支原体在机体内持续感染的意义还有待研究。参考结合分枝杆菌弱毒株诱导宿主巨噬细胞凋亡升高后产生保护性免疫反应，我们认为MbovP280蛋白具有制备免疫制剂的潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牛支原体MbovP280蛋白在制备牛支原体诊断试剂、药物或疫苗中的应用，该蛋白具有诱导宿主巨噬细胞活力下降和凋亡的能力。为了实现本专利技术的目的，申请人所在的农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室从牛支原体基因组中筛选出Mbov_0280基因，通过实验验证该基因编码的MbovP280蛋白可以在体外环境下诱导牛巨噬细胞活力下降和凋亡。参考结合分枝杆菌弱毒株诱导宿主细胞凋亡后提升机体免疫保护力的研究，我们认为MbovP280是研发新药和疫苗的重要潜在靶点。具体地，本专利技术的技术方案如下所述：申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到一株牛支原体本地分离株HB0801，申请人将其命名为牛支原体HB0801，MycoplasmabovisHB0801，本专利技术首先利用生物信息学工具预测牛支原体HB0801基因组中分泌脂蛋白，选取12个预测的分泌脂蛋白进行克隆表达纯化，通过检测各个蛋白刺激牛巨噬细胞和鼠巨噬细胞后的细胞活力，筛选出可以诱导巨噬细胞活力降低的MbovP280。Annexin-FITC/PI流式分析MbovP280蛋白可以诱导巨噬细胞凋亡。克隆过程中，根据大肠杆菌的密码子偏爱性进行了基因修饰，以保证其在大肠杆菌中表达。经过人工突变后的牛支原体基因Mbov_0280的核苷酸序列是序列表SEQIDNO:1的1-1020位碱基所示的序列，其长度为1020bp。该牛支原体MbovP280蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示，共编码339个氨基酸。将本专利技术的牛支原体Mbov_0280基因的核苷酸序列通过构建质粒载体pET-30a-Mbov_0280转化大肠杆菌DH5α得到重组大肠杆菌菌株，申请人将该重组的大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌pET-30a-Mbov_0280，EscherichiacolipET-30a-Mbov_0280。该菌株在IPTG诱导下，表达Mbov_0280基因编码的重组蛋白MbovP280。经过验证，本专利技术纯化的重组蛋白MbovP280具有诱导牛巨噬细胞活力下降和凋亡的功能。本专利技术所述的牛支原体rMbovP280诱导牛巨噬细胞凋亡的作用，包括下列步骤：利用CCK-8试剂盒检测5个脂蛋白刺激牛巨噬细胞和鼠巨噬细胞24小时后的细胞活力，实验结果显示仅rMbovP280可以引起牛巨噬细胞和鼠巨噬细胞细胞活力降低，且引起牛巨噬细胞活力降低的能力高于诱导鼠巨噬细胞活力降低的能力。利用Annexin-FITC/PI流式分析rMbovP280蛋白引起牛巨噬细胞凋亡的能力，实验结果发现将0.25μM、0.5μM、1μM的rMbovP280蛋白和牛巨噬细胞在37℃孵育24小时后，都可以检测到巨噬细胞的凋亡，其中1μM的rMbovP280蛋白刺激牛巨噬细胞24小时后细胞凋亡率为85.8％。本专利技术具有以下优点：1、本专利技术的牛支原体rMbovP280蛋白是从6个纯化的重组蛋白中筛选出的，相比其他5个蛋白rMbovP280可以引起牛和小鼠两种巨噬细胞细胞活力降低。2、本专利技术利用流式细胞术验证出MbovP280蛋白可以诱导BoMac细胞凋亡。因此该重组蛋白在制备牛支原体诊断试剂、药物或疫苗中具有广泛的应用前景。更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。附图说明图1：是实施例中空质粒pET-30a的质粒图谱。pET-30a为商业化质粒，购自Novagen公司。图2：是本专利技术制备的重组质粒pET-30a-Mbov_0280的图谱。重组质粒pET-30a-Mbov_0280是由pET-30a质粒和突变后的Mbov_0280基因全长经过限制性内切酶消化后连接重组而成。图3：是纯化的牛支原体rMbovP280诱导巨噬细胞活力降低。附图标记说明：4μg各个蛋白刺激1×104个巨噬细胞24h后细胞活力的检测。RAW：小鼠单核巨噬细胞；BoMac：牛巨噬细胞。t检验使用GraphPad软件分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，“ns”表示无差别。图4：是牛支原体MbovP280诱导牛巨噬细胞凋亡。附图标记说明：A：rMbovP280蛋白刺激BoMac细胞24h后Annexin-FITC/PI流式分析图；B：rMbovP280蛋白刺激BoMac细胞24h后凋亡细胞百分率。具体实施方式实施例1：牛支原体MbovP280蛋白的表达1.牛支原体Mbov_0280基因克隆表达由于大肠杆菌对密码子的偏爱性，在本专利技术中牛支原体中编码色氨酸的密码子UGA在大肠杆菌被用作终止子，因此，用大肠杆菌表达牛支原体基因时，需要对支原体基因进行突变，使密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG。申请人于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.牛支原体分泌蛋白MbovP280在制备牛支原体诊断试剂、药物或疫苗中的应用，所述牛支原体分泌蛋白MbovP280具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.牛支原体分泌蛋白MbovP280在制备牛支原体诊断试剂、药物或疫苗中的应用，所述牛支原体分泌蛋白MbovP280具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述牛支原体分泌蛋白MbovP280是以牛支原体Mbov_0280基因为模板，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，将该基因的密码子UGA突变为...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭爱珍，赵刚，伊赫萨努拉·希拉尼，陈颖钰，胡长敏，陈曦，陈建国，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42