一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法技术

本发明专利技术公开了一种BCR‑ABL1激酶结构域突变筛查方法，包括如下步骤：从样本中分离单个核细胞并提取RNA；将提取的RNA进行逆转录为cDNA，并进行PCR反应、纯化，获得包括BCR‑ABL1激酶结构域的扩增产物；对扩增产物进行测序文库构建；将测序文库在PGM测序平台上进行测序，根据测序结果确定突变位点及其变异等位基因频率，再根据突变位点的变异等位基因频率判断是否出现对TKI耐药的突变位点以及突变模式；本发明专利技术筛查方法能够准确获得样本序列中突变位点及其变异等位基因频率，确定低水平突变(＜20％)以及复合突变和多克隆突变；此外，该筛查方法结合巢式PCR的特点，采用特异性引物搭配使用，使得本发明专利技术筛查方法具有较高灵敏度和特异性具有较高的筛查灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法。
技术介绍
在BCR-ABL1融合基因阳性的白血病患者中出现BCR-ABL1激酶结构域(kinasedomain,KD)突变是对酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors,TKIs)治疗耐药的常见机制。在几乎所有研究中，当疾病复发时，在50％-80％的患者可检测到BCR-ABL1KD的突变。这些突变在生化和细胞分析中提示具有较高的IC50值。BCR-ABL1阳性白血病患者中最常见的imatinib耐药突变位点是T315I，除了ponatinib或单克隆抗体，其余第二代TKI(2G-TKIs)对T315I均无效。突变阳性的患者表现出极高的遗传不稳定性，这可能促进在相同(“复合”突变,compoundmutations)或不同(“多克隆”突变,polyclonalmutations)的BCR-ABL1融合基因阳性的细胞亚群中获得更多的突变，从而产生复杂的突变模式。越来越多的证据表明，合理使用微小残留病变(minimalresidualdisease,MRD)监测和BCR-ABL1KD突变筛查在BCR-ABL1阳性白血病治疗优化中起重要作用。然而，Sanger测序(SS)检测虽然是BCR-ABL1KD突变筛查的金标准，但这种方法的性质使它不适用于识别低水平变异(<20％VAF)，通常也不能够明确地区分发生在同一克隆中的多个突变(复合突变)或发生在单独克隆中的多个突变(多克隆突变)。这是因为SS产生的序列是混合的，不可能分析潜在亚克隆的基础结构和关系。复合或多克隆分析对于接受了多次连续TKIs治疗的重度患者以及可能具有复杂的潜在克隆结构的患者尤为重要，这些患者的亚克隆通常表现出多种突变模式。BCR-ABL1复合突变能够导致高度耐药性，即使是在新一代、高度活跃的TKIs环境中也如此，如ponatinib。体外研究表明，作为复合突变发生的E255V/T315I比单独发生的任一突变都具有更高的ponatinibIC50值。已有临床研究支持了在ponatinib治疗中E255V/T315I复合突变出现的不良影响。随着患者相继暴露于越来越多的TKIs，并发展出可能更为难以治疗的复杂突变模式，因此，确定复合突变与多克隆突变状态的重要性日益严峻。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法，该筛查方法能够准确获得样本序列中突变位点及其变异等位基因频率，确定低水平突变(＜20％)以及复合突变和多克隆突变，筛查的灵敏度较高。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术第一方面提供一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法，所述筛查方法包括如下步骤：(a)从样本中分离单个核细胞并提取RNA；(b)将提取的RNA进行逆转录为cDNA，并进行PCR反应、纯化，获得包括BCR-ABL1激酶结构域的扩增产物；(c)对扩增产物进行测序文库构建；(d)将测序文库在PGM测序平台上进行测序，根据测序结果确定突变位点的变异等位基因频率，再根据突变位点及其变异等位基因频率判断是否出现对TKI耐药的突变位点以及突变模式。本专利技术上述筛查方法能够准确获得样本序列中突变位点及其变异等位基因频率，确定低水平突变(＜20％)以及复合突变和多克隆突变，具有较高的筛查灵敏度。优选地，所述根据测序结果确定是否发生突变包括:将测序结果与hg19基因组数据进行对比分析，确定突变位点及其变异等位基因频率。优选地，所述单个核细胞的数量为(5～8)×106个。通过对单个核细胞数量的限定，能够提取到足够用于实验的RNA，为后续成功扩增、建库提供有力的前提条件。优选地，所述PCR反应包括巢式第一轮PCR反应和巢式第二轮PCR反应，巢式第二轮PCR反应以巢式第一轮PCR反应产物作为反应原料。优选地，所述巢式第一轮PCR反应采用的引物序列为：BCR190F：5’-TCCTTCGACAGCAGCAGTCC-3’(SEQIDNO:1)；BCR210F：5’-GAGCAGCAGAAGAAGTGTTTCAGA-3’(SEQIDNO:2)；ABL1R：5’-CAGGCACGTCAGTGGTGTCTC-3’(SEQIDNO:3)。优选地，所述第一轮PCR反应控制条件为：一次98℃下预变形20s；98℃下变形1s，60℃下退火20s，72℃下延伸30s，进行15个PCR循环。优选地，所述巢式第一轮PCR反应的扩增体系为20μl，具体包括：试剂体积Q5Mix10μl一轮引物2μl水4μlcDNA4μlTotal20μl。优选地，所述巢式第二轮PCR反应包括：采用两个引物池分别进行扩增，再将两个引物池扩增后产物混合，得到扩增产物，其中：一个引物池中引物序列为：ABL1-1F：5’-ACAAGTGGGAGATGGAACGCA-3’(SEQIDNO:4)；ABL1-1R：5’-AGGTAGTCCAGGAGGTTCCC-3’(SEQIDNO:5)；ABL1-3F：5’-GGAGAACCACTTGGTGAAGGT-3’(SEQIDNO:6)；ABL1-3R：5’-CTTCTCTGGGCAGCCTTCTG-3’(SEQIDNO:7)；另外一个引物池中引物序列为：ABL1-2F：5’-AGCTCCTTGGGGTCTGCAC-3’(SEQIDNO:8)；ABL1-2R：5’-CCCTGTCATCAACCTGCTCAG-3’(SEQIDNO:9)；ABL1-4F：5’-CCCTTACCCGGGAATTGACC-3’(SEQIDNO:10)；ABL1-4R：5’-TTCCCCAGCTCCTTTTCCAC-3’(SEQIDNO:11)；优选地，每个引物池的反应条件均为：一次98℃下预变形20s；98℃下变形1s，60℃下退火20s，72℃下延伸30s，进行23个PCR循环，之后在72℃下2min，再降温至10℃。优选地，所述巢式第二轮PCR反应中每个引物池的扩增体系为20μl，具体包括：试剂体积Q5Mix10μl二轮引物(1+3)/(2+4)2μl水6μl一轮扩增产物2μlTotal20μl。本专利技术通过对上述特定引物的选择以及反应条件的限定，使得PCR扩增具有较高的灵敏度和特异性。优选地，所述测序文本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(a)从样本中分离单个核细胞并提取RNA；/n(b)将提取的RNA进行逆转录为cDNA，并进行PCR反应、纯化，获得包括BCR-ABL1激酶结构域的扩增产物；/n(c)对扩增产物进行测序文库构建；/n(d)将测序文库在PGM测序平台上进行测序，根据测序结果确定突变位点及其变异等位基因频率，再根据突变位点及其变异等位基因频率判断是否出现对TKI耐药的突变位点以及突变模式。/n

【技术特征摘要】
1.一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)从样本中分离单个核细胞并提取RNA；
(b)将提取的RNA进行逆转录为cDNA，并进行PCR反应、纯化，获得包括BCR-ABL1激酶结构域的扩增产物；
(c)对扩增产物进行测序文库构建；
(d)将测序文库在PGM测序平台上进行测序，根据测序结果确定突变位点及其变异等位基因频率，再根据突变位点及其变异等位基因频率判断是否出现对TKI耐药的突变位点以及突变模式。


2.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，所述根据测序结果确定是否发生突变包括：
将测序结果与hg19基因组数据进行对比分析，确定突变位点及其变异等位基因频率。


3.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，所述单个核细胞的数量为(5～8)×106个。


4.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，所述PCR反应包括巢式第一轮PCR反应和巢式第二轮PCR反应，巢式第二轮PCR反应以巢式第一轮PCR反应产物作为反应原料。


5.根据权利要求4所述的筛查方法，其特征在于，所述巢式第一轮PCR反应采用的引物序列为：
BCR190F：5’-TCCTTCGACAGCAGCAGTCC-3’；
BCR210F：5’-GAGCAGCAGAAGAAGTGTTTCAGA-3’；
ABL1R：5’-CAGGCACGTCAGTGGTGTCTC-3’。


6.根据权利要求4或5所述的筛查方法，其特征在于，所述第一轮PCR反应控制条件为：一次98℃下预变形20s；98℃下变形1s，60℃下退火20s，72℃下延伸30s，进行15个PCR循环。


7.根据权利要求4所述的筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红星，滕文，谭印成，陈佳琦，
申请(专利权)人：北京陆道培生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11