一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞及其构建方法和应用。所述工程化免疫细胞提高基因编辑方法重编程得到，是一种同时表达NK细胞标志物和T细胞标志物的ITNK细胞，其具有较好的抗病毒活性，能够分泌IFNγ，实现对病毒包括冠状病毒在内的抑制和杀伤效果；同时，所述工程化免疫细胞能够在体外大量繁殖，解决了NK细胞在体外难以扩增的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞及其构建方法和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞及其构建方法和应用。
技术介绍
细胞重编程(cellreprogramming)指的是分化的细胞在特定的条件下被逆转后恢复到全能性状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新的个体的过程。在疾病的免疫治疗领域，已有通过细胞重编程来实现免疫细胞的类型转化的相关报道。例如，格拉斯通研究所(GladstoneInstitutes)曾报道，通过特定的重编程方法，将促炎的效应T细胞重编程为抗炎的调节性T细胞；这种重编程对于自身免疫性疾病的治疗意义重大，具体地，在自身免疫性疾病中，被过度激发的效应T细胞会对机体造成损害，将这些细胞转化为调节性T细胞有助于减少免疫系统的过度活跃，使其恢复平衡，从而根本上治疗疾病。目前，尚未见细胞重编程在人类感染疾病治疗中的应用。冠状病毒(COV)是迄今为止已知的一类具有广泛自然宿主的RNA病毒，其中，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)对公众健康构成了威胁。在许多病毒感染患者体内淋巴细胞，特别是自然杀伤细胞(NK细胞)水平下降。而NK细胞是天然免疫系统的重要组成部分，通过NKp46等NCR受体识别病毒及被病毒感染的细胞，参与多种病毒的免疫应答反应。NK细胞占外周血淋巴细胞约10～15％，是在天然免疫响应中起关键作用的淋巴样细胞。与T细胞不同的是，NK细胞以MHC非限制性方式识别其靶标。NK细胞可呈现抗病毒作用和抗癌作用。尽管NK细胞具有作为对抗感染性疾病或癌症的治疗剂的潜力，但是正常人体内大多的NK细胞以休眠状态存在，且NK细胞在体外难以大量培养很难应用于抗病毒治疗。因此，在体外获得足够数量的自然杀伤细胞十分重要。因此，提供一种能够在体外大量扩增且具有抗病毒作用的工程化免疫细胞对人类感染疾病治疗具有重要的意义。
技术实现思路
鉴于现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞及其构建方法和应用。利用细胞重编程方法构建出具有抗病毒活性的工程化免疫细胞，所得工程免疫细胞兼具T细胞和NK细胞的功能，同时还可以在体外大量扩增。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞，其特征在于，所述工程化免疫细胞为同时表达NK细胞标志物和T细胞标志物的ITNK细胞。本专利技术所述的工程化免疫细胞是能够同时表达NK细胞标志物和T细胞标志物的ITNK细胞，由T细胞重编程得到，所述T细胞可以从外周血和脐带血血液中分离，也可以由多能干细胞、造血干细胞定向诱导分化而来；所述工程化免疫细胞可以同时表达NK细胞和T细胞的抗原来识别和杀伤受体，说明其相比于NK细胞和T细胞具有更好的抗病毒能力；同时，所述工程化免疫细胞具有较好的体外扩增能力，可以解决了功能性NK细胞在体外难以扩增的难题。其中，所述NK细胞标志物包括CD16、CD56、CD69、NKp46、NKp30或NKp44中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述T细胞标志物包括CD3。第二方面，本专利技术提供一种工程免疫细胞的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：(1)将gRNA与Cas9蛋白基因连接到载体上，所述gRNA的靶基因包括Bcl11b基因，得到CRISPR/CAS9基因敲除载体；(2)通过电转化将所述CRISPR/CAS9基因敲除载体转入激活的T细胞中，培养后得到所述工程免疫细胞。本专利技术中，通过构建CRISPR/CAS9基因敲除载体，将T细胞重编程为ITNK细胞，所得工程化免疫细胞同时表达NK细胞标志物和T细胞标志物，具有更好的抗病毒能力；同时，使用所述方法构建得到的工程化免疫细胞具有较好的体外扩增能力，解决了功能性NK细胞在体外扩增难的问题。作为本专利技术优选的技术方案，步骤(1)所述gRNA敲除靶基因的第二外显子、第三外显子或第四外显子中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述gRNA敲除靶基因的第二外显子和/或第三外显子。优选地，所述gRNA的靶位点包括核苷酸序列GNNGG或CCNNC，所述N为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶中的任意一种。优选地，所述N为鸟嘌呤。作为本专利技术优选的技术方案，所述gRNA的靶点序列如SEQIDNO.1～17所示。优选地，步骤(1)所述gRNA包括正向引物和反向引物。优选地，步骤(1)所述gRNA包括SEQIDNO.18～51所示的引物对中的任意一对或至少两对的组合。优选地，所述gRNA包括如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:50和SEQIDNO:51所示的序列。根据CRISPR/CAS9靶位点的选择规则，以GN19NGG靶点序列，其中N19是靶位点，N最优选择为G，同时靶位点也可以在反义链上(即，在正义链上的序列顺序为：CCNN19C)，选择了靶点序列并分别设计了正向(F)、反向(R)引物作为guideRNA(gRNA)。其中，靶点序列如表1所示：表1编号序列(5′-3′)SEQIDNO:1GACCCTGACCTGCTCACCTGSEQIDNO:2GAAGCAGTGTGGCGGCAGCTSEQIDNO:3CAGGTGGTCATCTTCGTCGGSEQIDNO:4GCAGGTGGTCATCTTCGTCSEQIDNO:5GCTCAGGAAAGTGTCCGAGCSEQIDNO:6GAGTCCCGTCACCCGAGACCSEQIDNO:7GAAGTGATCACGGATGAGTGSEQIDNO:8GGTGACGGGACTCAGGGTGASEQIDNO:9TGCAGCGCGCGCCCGGTCTCSEQIDNO:10CACGAGAGCGACCCGTCGCTSEQIDNO:11GCGACGGGTCGCTCTCGTGGSEQIDNO:12TCCATGCTGAAGCTCGACTCSEQIDNO:13ACGGGTCGCTCTCGTGGTGGSEQIDNO:14AGCCGCAACCGCGAGAACGGSEQIDNO:15GCAACTTGACGGTGCACCGGSEQIDNO:16GAGCTGGGCCGCCCGGGGCCSEQIDNO:17GGTCAGACGGAGGCTCCCTT其中，gRNA的序列如表2所示(其中)：表2将gRNA退火、连接到酶切好的PX458载体上，构建载体PX458-gBC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞，其特征在于，所述工程化免疫细胞为同时表达NK细胞标志物和T细胞标志物的ITNK细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞，其特征在于，所述工程化免疫细胞为同时表达NK细胞标志物和T细胞标志物的ITNK细胞。


2.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其特征在于，所述NK细胞标志物包括CD16、CD56、CD69、NKp46、NKp30或NKp44中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述T细胞标志物包括CD3。


3.一种如权利要求1或2所述的工程化免疫细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
(1)将gRNA与Cas9蛋白基因连接到载体上，所述gRNA的靶基因包括Bcl11b基因，得到CRISPR/CAS9基因敲除载体；
(2)通过电转化将所述CRISPR/CAS9基因敲除载体转入激活的T细胞中，培养后得到所述工程化免疫细胞。


4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述gRNA敲除靶基因的第二外显子、第三外显子或第四外显子中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(1)所述gRNA敲除靶基因的第二外显子和/或第三外显子；
优选地，步骤(1)所述gRNA的靶位点包括核苷酸序列GNNGG或CCNNC，所述N为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶中的任意一种；
优选地，所述N为鸟嘌呤。


5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述gRNA的靶点序列如SEQIDNO.1～17所示；
优选地，步骤(1)所述gRNA包括正向引物和反向引物；
优选地，步骤(1)所述gRNA包括SEQIDNO.18～51所示的引物对中的任意一对或至少两对的组合；
优选地，步骤(1)所述gRNA包括如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:50和SEQIDNO:51所示的序列。


6.根据权利要求3～5任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：英基生物医药香港有限公司，
类型：发明
国别省市：中国香港;81