一种经修饰的干细胞及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种经修饰的干细胞及其制备方法和用途，所述干细胞可以实现在细胞植入受损部位前期持续分泌细胞因子释放到骨受损局部微环境抵消快速降解作用并促进本身骨及软骨的修复，又可避免在后期转入的目的基因持续表达所带来的负面影响。本发明专利技术还提供了一种培养物、药物组合物及其在制备骨修复药物方面的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种经修饰的干细胞及其制备方法和用途
本专利技术涉及细胞治疗
，具体涉及一种用于软骨修复治疗的双基因修饰干细胞及其制备方法和用途。
技术介绍
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，是肿瘤和心血管疾病及其他恶性疾病研究或治疗的重要手段。干细胞治疗在生命科学、新药试验和疾病研究这三大领域中具有巨大研究和应用价值，现已广泛应用于医药再生细胞替代治疗和药物筛选等领域。软骨缺损如椎间盘和膝关节的退化是关节残疾的常见原因，能够影响世界各地许多人的生活质量。关节软骨在损伤后自发修复的能力有限，接种自体软骨细胞以促进软骨再造具有一些优于同种异体软骨细胞或固体组织移植的好处。但由于在体外扩张期间软骨细胞去分化以及需要大量软骨样品，其应用受到限制。同时，骨骼疾病、肿瘤切除、创伤和先天性畸形也是需要骨重建的骨缺损的主要原因。几十年来，自体骨移植已经是临床上治疗骨缺损的金标准。由于自体骨移植物的有限的可用性和供体位点的发病率，基于干细胞的组织工程策略作为替代性治疗方法是非常有希望的。但是，由于免疫排斥、早期再吸收和可能的感染传播等原因，限制了同种异体移植的使用。近年来，骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子在骨折愈合中的使用越来越广泛。骨形态发生蛋白(BMP)，除了BMP-1(730个氨基酸组成的富含半胱氨酸的前胶原C蛋白酶)外，均属于转化生长因子-β(TGF-β)超基因家族。目前体内外实验均证实，BMP能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织。与胚胎骨骼形成有关的蛋白质，在骨形成的数个阶段均起作用，由形态发生的早期阶段开始，并延续至出生后，在中枢神经的发生中也起着关键作用。BMP在临床的价值无可限量，近年来基因重组的骨BMP2和BMP7的安全性和有效性得到了充分的证实，美国FDA也于2002年7月批准重组BMP2用于脊柱融合，基于骨形态发生蛋白的安全性和高效诱导成骨活性被越来越多的实验所证实，在一些国家BMP已进入大规模的临床实验阶段。成纤维细胞生长因子(FGFs)——约150-200个氨基酸组成的多肽，以两种密切相关的形式存在，即碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)。两种FGF都刺激分离大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞的DNA合成，同时bFGF刺激分化软骨细胞在琼脂中的集落形成，起丝裂原和形态作用，FGF在活体内增加分化较差的前成骨细胞的数量。将FGF加入鸡胚，可使成骨细胞、软骨细胞增殖及骨基质形成。但是，在应用过程中，骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子存在一些不良作用，特别是在高剂量下，主要体现在以下方面：(1)更高的骨折不连续率；(2)局部炎症反应；(3)伤口愈合并发症；(4)血肿形成；(5)异位骨形成。这些不良作用仍然需要进一步研究，以期在今后的临床应用中逐渐减少。同时，由于骨形态发生蛋白在体内被机体的酶类降解可以很快失去作用，促使许多研究者将目光投向了骨形态发生蛋白的基因治疗研究，即用基因转移(genetransfer)和基因转染(genetransfection)。但是，由于未做长期的实验观察，对于其后期的组织衍变过程尚缺乏实验资料，且对于基因治疗中存在的不可控性和基因突变等问题都需要长期的观察。基于上述原因，有必要对干细胞进行改进以提高其向成骨和成软骨分化诱导效率，同时提高其在骨修复中的安全性。
技术实现思路
为了克服上述问题，本专利技术人进行了锐意研究，设计出一种经修饰的间充质干细胞，其通过将目的基因FGF18和BMP2构建到Tet-on系统，并转染至间充质干细胞得到，可以实现在细胞植入受损部位前期持续分泌细胞因子释放到骨受损局部微环境抵消快速降解作用并促进本身骨及软骨的修复，又可避免在后期转入的目的基因持续表达所带来的负面影响，从而完成了本专利技术。具体来说，本专利技术的目的在于提供以下方面：第一方面，提供了一种经修饰的干细胞，其中，所述干细胞包括能够表达第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白选自FGF18、FGF18变体或者包含所述FGF18或FGF18变体的第一融合蛋白；所述第二蛋白选自BMP2、BMP2变体或者包含所述BMP2或BMP2变体的第二融合蛋白。第二方面、提供了一种干细胞的制备方法，优选用于制备第一方面所述的经修饰的干细胞，所述方法包括以下步骤：步骤1，构建含有第一外源核酸和第二外源核酸的表达载体；步骤2，将表达载体转染至干细胞，获得经修饰的干细胞。第三方面、提供了一种培养物，所述培养物包括第一方面所述的干细胞或第二方面所述方法制备的干细胞，以及培养基。第四方面，提供了一种药物组合物，其中，所述组合物包括第一方面所述的干细胞或第二方面所述方法制备的干细胞，或者包括第三方面所述的培养物。第五方面，提供了一种第一方面所述的干细胞或第二方面所述方法制备的干细胞、第三方面所述的培养物或第四方面所述的药物组合物在制备骨修复药物方面的应用。本专利技术所具有的有益效果包括：(1)本专利技术提供的经修饰的干细胞，在改进BMP2联合MSC应用安全性的同时，进一步联合本身即具有促进成骨和成软发生、又可在上游调控BMP发生和表达的FGF18基因，通过两个因子的共同作用，显著提高了MSC细胞像成骨和成软分化诱导的效率，实现了多功能且安全的MSC细胞在骨修复中的应用；(2)本专利技术提供的经修饰的干细胞，采用Tet-Off/Tet-On系统进行基因转染，实现了再细胞植入受损部位后，瞬时启动短暂表达骨修复基因，在诱导骨发生后，即可停止诱导目的基因FGF18和BMP2的表达，从而可在前期将持续分泌细胞因子释放到骨受损局部微环境抵消快速降解作用并促进本身骨及软骨的修复，又可避免在后期转入的目的基因持续表达所带来负面影响。附图说明图1示出本专利技术实施例1制备的Fuw-FGF18-BMP2的图谱；图2示出本专利技术实施例1制备重组慢病毒时的转染效率电镜图；图3示出本专利技术实施例1制备的重组慢病毒的活性及基因侧漏表达验证结果图；图4示出本专利技术实验例1中DOX的使用浓度检测结果；图5示出本专利技术实验例2中修饰干细胞的表型检测结果；图6示出本专利技术实验例3中细胞因子表达检测(蛋白水平)结果；图7示出本专利技术实验例3中细胞因子表达检测结果(分子水平)；图8示出本专利技术实验例4中成软骨、成骨和成脂诱导21天的染色结果；图9示出本专利技术实验例4中成软骨诱导21天的染色结果；图10示出本专利技术实验例4中成骨诱导14天的染色结果。具体实施方式下面通过优选实施方式和实施例对本专利技术进一步详细说明。通过这些说明，本专利技术的特点和优点将变得更为清楚明确。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本专利技术人研究发现，成纤维细胞生长因子(FGFs)中的成员FGF18是一个由207个氨基酸组成的高度保守蛋白，与已发现的FGF其他成员有30％～70％的同源性。FGF18与FGF8、FGF17相似，为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经修饰的干细胞，其特征在于，所述干细胞包括能够表达第一蛋白和第二蛋白，/n所述第一蛋白选自FGF18、FGF18变体或者包含所述FGF18或FGF18变体的第一融合蛋白；/n所述第二蛋白选自BMP2、BMP2变体或者包含所述BMP2或BMP2变体的第二融合蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种经修饰的干细胞，其特征在于，所述干细胞包括能够表达第一蛋白和第二蛋白，
所述第一蛋白选自FGF18、FGF18变体或者包含所述FGF18或FGF18变体的第一融合蛋白；
所述第二蛋白选自BMP2、BMP2变体或者包含所述BMP2或BMP2变体的第二融合蛋白。


2.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，所述经修饰的干细胞包括第一外源核酸和第二外源核酸，
所述第一外源核酸包含编码第一蛋白的核苷酸序列；
第二外源核酸包含编码第二蛋白的核苷酸序列。


3.根据权利要求2所述的干细胞，其特征在于，所述第一外源核酸和第二外源核酸独立于干细胞的基因组，二者位于表达载体上，
优选地，所述第一外源核酸和第二外源核酸通过连接序列连接，并位于同一表达载体上。


4.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞，来源于脂肪组织、脐带、骨髓或脐血。


5.一种干细胞的制备方法，优选用于制备权利要求1至4之一所述的经修饰的干细胞，其特征在于，所述方法包括以下步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：段海峰，薛冰华，于婷婷，解晶，鲁飞，肖秀孝，张群伟，庞如梦，栾佳蒙，秦亚茹，
申请(专利权)人：北京纽莱福生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11