一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，涉及蛋白质活性研究领域，包括钛粉负载、储存液保存和固液分离提取使用纤连蛋白等步骤，本发明专利技术将纯钛粉表面活化后可以有效负载纤连蛋白，并保持其生物活性，储存液中高浓度的蛋白酶抑制剂及蛋白保护剂可有效防止蛋白降解，较好的维持存储过程中纤连蛋白的生物学活性。使用时，可通过固液分离的方法提取纤连蛋白而去除有害蛋白保护成分如毒性剂量的PMSF或EDTA或其他干扰实验的保护成分，简单高效的完成纤连蛋白提取使用，并不影响其在细胞实验中的活性应用及研究。

【技术实现步骤摘要】
一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法
本专利技术涉及蛋白质活性研究领域，特别涉及一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法。
技术介绍
纤维连接蛋白(Fn)是一类细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)蛋白，在细胞与细胞、细胞与基膜间起到桥联作用，维持细胞的正常形态和功能，它可以与肝素、肌动蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白、DNA和细胞结合。其重要作用是促进细胞的黏连和粘附，可提高细胞的贴壁率、汇合率，缩短细胞汇合时间，使细胞形态结构良好，代谢率增强及蛋白质合成速度显著提高。对于经常需要使用的纤连蛋白，一般将纤连蛋白放在-20度保存，为了避免纤连蛋白反复冻融，一般的做法是在纤连蛋白中加入一定量的甘油，但仅仅加入甘油，可以避免纤连蛋白反复冻融，但不能有效的防止纤连蛋白的降解。且由于保护剂的成分比较多，加入的量不同对纤连蛋白的影响也不一样，所以需要一种方法来保护纤连蛋白稳定性和生物学活性。常用的蛋白保护剂有甘油、甘露醇、聚乙二醇、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、牛血清白蛋白等。在实际操作中很难用单一保护剂实现对纤连蛋白的有效保护，因此，为了增强保护效果，通常需要将保护剂进行搭配使用。所以需要开发更优的纤连蛋白保护剂。现有的蛋白酶抑制剂虽然可以防止蛋白降解，但有细胞毒作用，影响纤连蛋白储存液在体外细胞实验中的应用。LBL技术一般是先将表面带电荷的基片浸入含有带相反电荷的聚电解质溶液中，静置一段时间后取出清洗去掉吸附不牢的聚电解质，完成表面物质吸附过程。采用该法在常温下即可制备各种吸附膜层，且稳定性较好，是一种构筑复合有机/无机涂层的有效方法。LBL自组装膜可以负载多种生物分子，如多糖、蛋白质和酶等。商业纯钛(Ti)及其合金具有优良的抗腐蚀性能以及良好的生物相容性，并且已经广泛应用于整形材料、牙修复材料和心血管植入材料等领域，比如人工关节，牙植入物和心脏瓣环，无细胞毒性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题：纤连蛋白的储存防降解方法妨碍纤连蛋白在细胞实验中的蛋白活性研究应用，尤其是蛋白储存液中毒性剂量的蛋白酶抑制剂对细胞的毒性作用影响纤连蛋白在细胞实验中的生物活性应用。为解决上述技术问题，本专利技术提供以下的技术方案：一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，具体步骤如下：(1)将纤连蛋白固定于活化后的纯钛粉表面；(2)将固定有纤连蛋白的固体粉末加入储存液中充分混匀后-20℃保存，所述储存液中包含蛋白酶抑制剂和蛋白保护剂；(3)使用前离心去除储存液，PBS或TBS清洗沉淀后重悬至工作浓度即得纤连蛋白工作液。优选地，所述纤连蛋白固定于Ti表面的方法如下：(a)纯钛粉依次用丙酮，无水乙醇和蒸馏水超声清洗两次，每次5min，干燥备用；(b)另配制0.5M的NaOH溶液，将上述已经干燥的纯钛粉浸没在该溶液中70℃下反应24h后，充分用蒸馏水进行清洗后干燥，得到活化钛粉；(c)配制2％氨丙基三乙氧基硅烷APTE溶液，溶剂为无水乙醇，将活化钛粉放入APTE溶液中37℃下震荡反应10h；再经无水乙醇清洗后在120℃下固化反应6h以增强APTE与活化钛粉表面的结合，得到硅烷化钛粉A；(d)用EDC/NHS/PBS体系配制浓度为150μg/mL的纤连蛋白溶液，纤连蛋白溶液pH7.0；(e)将硅烷化钛粉A重悬浸泡在纤连蛋白溶液中反应15min，0.01M的PBS洗掉未结合的纤连蛋白分子，离心后去除上清即可。优选地，所述蛋白酶抑制剂为40～100mM的PMSF和1mM的PepstatinA。优选地，所述蛋白保护剂由如下原料组成：终浓度50～200mM的精氨酸、蛋白保护剂总重0.2～2wt％的牛血清白蛋白、终浓度0.3mg/mlEDTA，蛋白保护剂总重40wt％的甘油，采用溶剂为Tris-NaCl缓冲液，所述Tris-NaCl缓冲液为终浓度50mM的Tris，终浓度100mM的NaCl，pH8.0。优选地，还包括如下步骤：将硅烷化钛粉B浸泡在5～10μg/mL亮抑蛋白肽酶溶液中吸附固定15min，随后0.01M的PBS洗掉未结合的亮抑蛋白肽酶，将固定吸附有亮抑蛋白肽酶的钛粉加入储存液中，再与固定有纤连蛋白的固体粉末充分混合。优选地，所述硅烷化钛粉B的粒径为硅烷化钛粉A粒径的100倍。本专利技术获得的有益效果：纯钛粉表面活化后可以有效负载纤连蛋白，并保持其生物活性，储存液中高浓度的蛋白酶抑制剂及蛋白保护剂可有效防止蛋白降解，较好的维持存储过程中纤连蛋白的生物学活性。使用时，可通过固液分离的方法提取纤连蛋白而去除有害蛋白保护成分如毒性剂量的PMSF或EDTA或其他干扰实验的保护成分，简单高效的完成纤连蛋白提取使用，并不影响其在细胞实验中的活性应用及研究。具体实施方式下面通过对实施例的描述，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本专利技术的专利技术构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。实施例1：按如下方法保存和使用纤连蛋白：(1)将纤连蛋白固定于活化后的纯钛粉表面，具体方法如下：(a)将粒径为0.2mm的10g纯钛粉依次用丙酮，无水乙醇和蒸馏水超声清洗两次，每次5min，干燥备用；(b)另配制0.5M的NaOH溶液，将上述已经干燥的纯钛粉浸没在该溶液中70℃下反应24h后，充分用蒸馏水进行清洗后干燥，得到活化钛粉；(c)配制2wt％氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)溶液，溶剂为无水乙醇，将活化钛粉放入APTE溶液中37℃下震荡反应10h；再经无水乙醇清洗后在120℃下固化反应6h以增强APTE与活化钛粉表面的结合，得到硅烷化钛粉A；(d)用EDC/NHS/PBS体系配制浓度为150μg/mL的纤连蛋白溶液，纤连蛋白溶液pH7.0；(e)将1g硅烷化钛粉A重悬浸泡在5mL纤连蛋白溶液中反应15min，0.01M的PBS洗掉未结合的纤连蛋白分子，离心后去除上清即可。(2)按1g：100mL将固定有纤连蛋白的固体粉末加入储存液中充分混匀后-20℃保存，所述储存液中包含终浓度40mM的PMSF和终浓度1mM的PepstatinA及蛋白保护剂；所述蛋白保护剂由如下原料组成：终浓度50mM的精氨酸、蛋白保护剂总重0.2wt％的牛血清白蛋白、终浓度0.3mg/mlEDTA，蛋白保护剂总重40wt％的甘油，采用溶剂为Tris-NaCl缓冲液，所述Tris-NaCl缓冲液为终浓度50mM的Tris，终浓度100mM的NaCl，pH8.0。由于PMSF及PepstatinA在低浓度水溶液中易失效，因此采用接近或等同储存浓度的高浓度对蛋白进行长期保护，防止蛋白酶降解，由于后续会去除储存液，所以高浓度的蛋白抑制剂也不会对细胞实验产生毒性影响。(3)使用前离心去除储存液，PBS或TBS清洗沉淀后重悬至工作浓度即得纤连蛋白工作液。实施例2：按如下方法保存和使用纤连蛋白：(1)将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于，具体步骤如下：/n(1)将纤连蛋白固定于活化后的纯钛粉表面；/n(2)将固定有纤连蛋白的固体粉末加入储存液中充分混匀后-20℃保存，所述储存液中包含蛋白酶抑制剂和蛋白保护剂；/n(3)使用前离心去除储存液，PBS或TBS清洗沉淀后重悬至工作浓度即得纤连蛋白工作液。/n

【技术特征摘要】
1.一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将纤连蛋白固定于活化后的纯钛粉表面；
(2)将固定有纤连蛋白的固体粉末加入储存液中充分混匀后-20℃保存，所述储存液中包含蛋白酶抑制剂和蛋白保护剂；
(3)使用前离心去除储存液，PBS或TBS清洗沉淀后重悬至工作浓度即得纤连蛋白工作液。


2.根据权利要求1中所述的一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于：所述纤连蛋白固定于钛粉表面的方法如下：
(a)纯钛粉依次用丙酮，无水乙醇和蒸馏水超声清洗两次，每次5min，干燥备用；
(b)另配制0.5M的NaOH溶液，将上述已经干燥的纯钛粉浸没在该溶液中70℃下反应24h后，充分用蒸馏水进行清洗后干燥，得到活化钛粉；
(c)配制2％氨丙基三乙氧基硅烷APTE溶液，溶剂为无水乙醇，将活化钛粉放入APTE溶液中37℃下震荡反应10h；再经无水乙醇清洗后在120℃下固化反应6h以增强APTE与活化钛粉表面的结合，得到硅烷化钛粉A；
(d)用EDC/NHS/PBS体系配制浓度为150μg/mL的纤连蛋白溶液，纤连蛋白溶液pH7.0；
(e)将硅烷化钛粉A重悬浸泡在纤连蛋白溶液中反应15min，0.01M的PBS洗掉未结合的纤连蛋白分子，离...

【专利技术属性】
技术研发人员：王梦，刘洁，刘家炉，徐文俊，单雪芹，凡玉芳，王亚男，李诚茹，吴蕾，金巢，
申请(专利权)人：安徽九川生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34