本发明专利技术提供了一种EGFR‑CD3双功能抗体，所述双功能抗体包括2条相同的轻链和2条相同的重组重链，其中每条所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，每条所述重组重链由EGFR抗体重链与CD3蛋白的单链抗体scFv通过接头序列连接组成，所述EGFR抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述接头序列linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述CD3蛋白的单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的任一项所示。本发明专利技术的EGFR‑CD3双功能抗体能够与人CD3蛋白和EGFR特异性结合，降低鼠源抗体的免疫原性，同时有效激活T细胞，并阻断人EGF与EGFR的结合，可以通过结合EGFR锚定在肿瘤细胞表面，并通过与CD3结合激活T细胞，起到杀伤肿瘤细胞的目的。
【技术实现步骤摘要】
EGFR-CD3双功能抗体及其应用
本专利技术涉及抗体，具体涉及能够阻断人EGF与EGFR结合并激活T细胞的双功能抗体。
技术介绍
CD3蛋白是T细胞表面表达从刺激信号分子，其在T细胞激活起着非常重要的作用。CD3分子与TCR组成复合受体分子，激活酪氨酸激酶，促使CD3分子免疫受体酪氨酸活化基序中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应，调控T细胞增殖和活化的靶基因，引起基因的表达和转录，T细胞由静止状态转为增殖和活化状态。CD3分子具有稳定TCR结构和传递活化信号的作用。针对CD3分子的单克隆抗体能够激发或阻断T细胞活化信号转导，清除效应T细胞或诱导调节T细胞的产生，为治疗器官移植排斥和自身免疫性疾病提供了新的方法。鼠源性单克隆抗体Muromonab-CD3(莫罗单抗，克隆号OKT3)能够显著激活T细胞，引起细胞细胞增殖。莫罗单抗是一种鼠单克隆抗体，用于治疗肾、心、肝移植后的急性排异反应，其主要机理是通过诱导调节性T细胞(Treg)增殖，并抑制杀伤性T(Teff)功能活性。其临床应用会引起宿主排斥反应，儿童患者使用该药可能增加致严重的神经系统并发症的风险，尤其是脑水肿和脑疝。借助抗体人源化的技术，可以降低鼠源性抗体的免疫原性。抗体人源化技术主要是指通过对鼠源(或其他动物种属)的单克隆抗体的氨基酸序列进行替换，使替换后的蛋白序列为人源序列或与之相似，同时保留单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其对人体的异源性。抗体人源化通常对鼠源(或其他动物种属)抗体的可变区(CDR)进行氨基酸改变，而对抗体的恒定区部分(即CH和CL区)序列进行人类抗体基因序列的改变或替换。人源化抗体可以大大减少抗体药物对人类机体造成的例如，宿主免疫排斥，抗药抗体产生等毒副作用。EGFR单抗药物，西妥昔单抗(Cetuximab)是第一个在全球多个国家获准上市的靶向作用于表皮生长因子受体(EGFR)的IgG1亚型人-鼠嵌合单克隆抗体，被批准用于治疗转移性结直肠癌和难治性头颈癌。Cetuximab通过靶向结合EGFR阻断EGFR与其天然配体EGF结合，从而打断细胞自泌性无限增殖的恶性循环，抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制内皮细胞增生和新生血管形成，抑制癌细胞侵袭、转移，增强细胞毒药物、电离辐射的抗癌作用。双功能抗体是指具有双特异性的抗体，具有结合两种不同抗原的能力，是一种非天然抗体。通常采用基因工程法构建多种功能、多种用途的双功能抗体。双功能抗体作为一种新的药物在临床治疗中具有非常大的应用价值。T细胞重定向双功能抗体(TRBAs)是一种基于CD3抗体招募T细胞至靶细胞周围的一种双功能抗体。该双功能抗体的两臂能同时结合CD蛋白和肿瘤相关抗原，一方面通过结合CD3蛋白招募和激活T细胞介导肿瘤免疫，另一方面通过结合肿瘤相关抗原(TAA)把T细胞和肿瘤细胞拉近，这样可以更高效、更特异地杀伤肿瘤细胞，显著降低免疫毒副作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于结合西妥昔单抗和CD3单抗两种抗体的优势，提供了靶向肿瘤相关抗原和T细胞的双功能抗体，该双功能抗体既能阻断人EGF与EGFR的结合，还能招募免疫T细胞到肿瘤组织周围并激活T细胞，分泌IFNγ细胞因子，同时克服鼠源性CD3抗体的缺陷，降低免疫原性。为实现上述目的，本专利技术提供了一种EGFR-CD3双功能抗体，所述双功能抗体包括2条相同的轻链和2条相同的重组重链，其中每条所述轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，每条所述重组重链由EGFR抗体重链与CD3蛋白的单链抗体scFv通过接头序列连接组成，所述EGFR抗体重链的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，所述接头序列linker的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，所述CD3蛋白的单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5或SEQIDNO.6所示。作为一种优选的实施方案，所述重组重链的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。作为一种优选的实施方案，所述重组重链的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示。作为一种优选的实施方案，所述重组重链的氨基酸序列如SEQIDNO.12所示。作为一种优选的实施方案，所述重组重链的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示。作为一种优选的实施方案，所述重组重链的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示。作为一种优选的实施方案，所述重组重链的氨基酸序列如SEQIDNO.15所示。另一方面，本专利技术还提供了一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码所述的EGFR-CD3双功能抗体。另一方面，本专利技术还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所述的EGFR-CD3双功能抗体。另一方面，本专利技术还提供了所述EGFR-CD3双功能抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。优选地，所述肿瘤包括但不限于结直肠癌和/或头颈肿瘤。本专利技术提供的EGFR-CD3双功能抗体对鼠源人鼠嵌合抗体OKT3的高度可变区(包括VH和VL)进行了人源化改造，并用特定接头序列进行融合连接，成为单链抗体(scFv)，同时具有特异性结合人CD3蛋白与特异性结合人EGFR蛋白的作用，既能阻断人EGF与EGFR的结合，还能招募免疫T细胞到肿瘤组织周围并激活T细胞，诱导分泌IFNγ细胞因子，促进T细胞分化增殖用，对EGFR表达的上皮癌细胞A431具有杀伤作用，同时克服鼠源性CD3抗体的缺陷，降低免疫原性，能够用于治疗EGFR阳性表达的实体瘤，特别是结直肠肿瘤和头颈肿瘤。附图说明图1是本专利技术的EGFR-CD3双功能抗体的结构示意图。图2是采用流式细胞方法检测本专利技术的EGFR-CD3双功能抗体对细胞表面CD3蛋白的结合能力的结果。图3为采用流式细胞方法检测本专利技术的EGFR-CD3双功能抗体对细胞表面EGFR蛋白的结合能力的结果。图4示出了EGFR-CD3双功能抗体对肿瘤细胞的杀伤作用。具体实施方式为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。值得注意的是，出于简要清楚的目的，以下实施例中对一些常规的技术操作步骤、试剂、仪器并未进行细致的描述，但应理解，如未特别说明，这些常规技术操作步骤、试剂、仪器对本领域普通技术人员而言是显而易见的。下面结合具体实例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。以下实施例内容包括CD3的单链抗体scFv的人源化改造和双功能抗体的构建。本专利技术的EGFR-CD3双功能抗体中的CD3单链抗体的人源化通过分别进行重链可变区的框架区(Framwork)和抗原互补决定簇区域(CDR)进行人源氨基酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种EGFR-CD3双功能抗体，所述双功能抗体包括2条相同的轻链和2条相同的重组重链，其中每条所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，每条所述重组重链由EGFR抗体重链与CD3蛋白的单链抗体scFv通过接头序列连接组成，所述EGFR抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述接头序列linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述CD3蛋白的单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5或SEQ ID NO.6的任一项所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种EGFR-CD3双功能抗体，所述双功能抗体包括2条相同的轻链和2条相同的重组重链，其中每条所述轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，每条所述重组重链由EGFR抗体重链与CD3蛋白的单链抗体scFv通过接头序列连接组成，所述EGFR抗体重链的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，所述接头序列linker的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，所述CD3蛋白的单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5或SEQIDNO.6的任一项所示。
2.根据权利要求1所述的EGFR-CD3双功能抗体，其特征在于，所述重组重链的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。
3.根据权利要求1所述的EGFR-CD3双功能抗体，其特征在于，所述重组重链的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示。
4.根据权利要求1所述的EGFR-CD3双功能抗体，...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶才果，王笑非，汪波，
申请(专利权)人：佛山安普泽生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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