超折叠维纳斯黄色荧光蛋白及其在莱茵衣藻中的表达制造技术

本发明专利技术公开了一种超折叠维纳斯黄色荧光蛋白及其在莱茵衣藻中的表达。所述的超折叠维纳斯黄色荧光蛋白在绿色荧光蛋白氨基酸序列的基础上，还含有维纳斯黄色荧光蛋白和超折叠绿色荧光蛋白的诱变氨基酸，氨基酸序列为序列表SEQ NO.1。本发明专利技术的SfvYFP的表达量约为venus YFP的1.5倍，两个串联的SfvYFP的表达量高于单个的SfvYFP，约为其1.2倍，三个串联的SfvYFP的表达量约为单个SfvYFP的0.6倍，将SfvYFP与目标蛋白融合表达，转化并整合到莱茵衣藻核基因组中，可以提高外源蛋白的表达量，也可以更加方便地定位外源蛋白的表达位置。

【技术实现步骤摘要】
超折叠维纳斯黄色荧光蛋白及其在莱茵衣藻中的表达
本专利技术属于蛋白表达
，涉及一种超折叠维纳斯黄色荧光蛋白及其在模式生物单细胞莱茵衣藻核基因组中的表达。
技术介绍
莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是一种真核双鞭毛淡水绿藻，是研究多种生命活动，如光合作用、鞭毛组装、趋光性和生理节律的模式生物。莱茵衣藻因与酵母细胞有许多共同的特征，素有“光合酵母”之称。另外，莱茵衣藻安全、培养成本低廉、生长周期短且易于培养，其全基因组测序工作已经完成，并且针对核基因组、叶绿体基因组和线粒体基因组的遗传转化体系也已经比较成熟。因此，莱茵衣藻具有作为人类和动物治疗性蛋白和工业用酶生产平台的前景。目前，绿色荧光蛋白(GFP，GreenFluorescentProtein)已经广泛应用到莱茵衣藻的研究中，人们不仅构建了整合到核基因组中的核密码子优化的基因(CrGFP)，而且构建了整合到叶绿体基因组中的叶绿体密码子优化的基因。与整合到核基因组中并表达蛋白相比，尽管整合到叶绿体基因组中并表达GFP有不少优势，包括有助于荧光检测和利用的较高蛋白质积累量，但缺点是蛋白总是局限在叶绿体内。因此，许多荧光蛋白(FP)的应用无法实现，包括标记不在叶绿体中的蛋白质、细胞器标记和核启动子研究等。但是，整合到莱茵衣藻核基因组中的外源基因的蛋白表达水平非常低，可能的原因有核基因组中存在非常规的表观遗传抑制行为和/或极其紧凑的不允许转基因活跃转录的染色体结构。另外，莱茵衣藻本身能生产妨碍GFP检测的多种高荧光色素，如叶绿素和黄酮类化合物，这使得GFP表达水平低的问题更加复杂。GFP也可以与内源性基因融合表达。例如，将GFP与鞭毛蛋白融合表达，可以通过荧光显微镜成功地在活细胞中成像。然而，这往往需要专门的活细胞成像技术，以压倒细胞体产生的自发荧光从而检测GFP的信号。这些技术包括使用马赛克数字照明系统来控制被照明样本的面积，或共聚焦或全内反射荧光显微镜，但是这些技术都需要将鞭毛粘附在盖玻片上，将自发荧光细胞体置于照明区域之外。人们也曾将GFP与细胞体的蛋白质融合表达，例如，将GFP与细胞质膜蛋白Rh1融合表达。然而，为了克服自发荧光，需要使用莱茵衣藻的白色突变株，这种白色突变株是通过阻断类胡萝卜素生物合成的第一步而得到的。尽管如此，在莱茵衣藻核基因组中稳定表达单体FP和FP融合蛋白还是取得了一些成功。将维纳斯黄色荧光蛋白(venusYFP，venusYellowFluorescentProtein)或者CrGFP和抗生素抗性基因APHⅧ放入同一个质粒pJR39或者pJR38中，并分别由不同的启动子启动表达、不同的终止子终止，venusYFP和APHⅧ均可以在莱茵衣藻诱变株UVM4或者UVM11中稳定表达。抗生素抗性基因APHⅧ通过药物隔离而不是酶灭活发挥作用，对巴龙霉素或者卡那霉素均具有抗性，可以在含有这些抗生素的平板上挑取转化株单克隆。UVM4和UVM11是通过将细胞壁缺陷型莱茵衣藻cw15进行紫外诱变得到的过表达外源蛋白的诱变株。另外，将FP与抗生素抗性基因sh-ble融合表达，蛋白定位于细胞核中。抗生素抗性基因sh-ble对博来霉素具有抗性，是一个很好的融合伙伴，因为在抗生素选择过程中，需要高水平的蛋白表达才能使细胞存活。另外，在sh-ble与FP之间插入来自口蹄疫病毒(FMDV，FootandMouthDiseaseVirus)的自剪切2A肽段可以使未融合、未靶向的单体FP(红色mCherry、橙色tdTomato、黄色venus、绿色CrGFP、青色mCerulean或蓝色mTagBFP)聚集起来。研究表明，FMDV2A肽在莱茵衣藻中可以进行有效的自剪切，因而ble-2A表达载体会得到高水平的CrGFP积累量，约占可溶性全蛋白(TSP，TotalSolubleProteins)的0.25％，并且在活细胞显微镜下可以检测到荧光。由于CrGFP的信噪比较低，其荧光强度最小，而发射波长较长的FP(venus、tdTomato和mCherry)的信噪比较高，荧光强度较强。到目前为止，尽管FP在微藻领域的应用正在逐步扩大，但是整合到核基因组中的外源基因非常低的蛋白表达水平和诸如莱茵衣藻非常高的自发荧光仍然在阻碍着FP在微藻领域中的进一步的运用。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于莱茵衣藻核基因组转化的新型报告基因，为含有16个诱变氨基酸的超折叠维纳斯黄色荧光蛋白(SfvYFP，SuperfoldervenusYellowFluorescentProtein)，并将其针对莱茵衣藻核基因组密码子偏好性进行了100％的优化，并分别构建了含有单个、两个串联和三个串联超折叠维纳斯黄色荧光蛋白的质粒，分别转入并整合到莱茵衣藻核基因组中进行了蛋白表达。本专利技术的技术方案如下：本专利技术的超折叠维纳斯黄色荧光蛋白SfvYFP，它在原有GFP氨基酸序列的基础上改变了16个氨基酸，即在venusYFP的9个诱变氨基酸F46L、F64L、S65G、V68L、S72A、M153T、V163A、S175G和T203Y的基础上，增加7个来自SuperfolderGFP的诱变氨基酸S30R、Y39N、F99S、N105T、Y145F、I171V和A206V，即分别是S30R、Y39N、F46L、F64L、S65G、V68L、S72A、F99S、N105T、Y145F、M153T、V163A、I171V、S175G、T203Y和A206V，其氨基酸序列如序列表SEQNO.1所示。本专利技术还提供上述超折叠维纳斯黄色荧光蛋白SfvYFP的基因序列，针对莱茵衣藻核基因组的密码子偏好性进行了100％的优化，其核苷酸序列如序列表SEQNO.2所示。本专利技术进一步提供含有单个SfvYFP、两个串联SfvYFP和三个串联SfvYFP的重组质粒，所述的串联为两个SfvYFP之间由两个甘氨酸GGCGGC连接。作为本专利技术的一个具体实施例，所述的含有单个SfvYFP的重组质粒为核苷酸序列如序列表SEQNO.11所示的pCYX003。作为本专利技术的一个具体实施例，所述的含有两个串联SfvYFP的重组质粒为核苷酸序列如序列表SEQNO.14所示的pCYX004。作为本专利技术的一个具体实施例，所述的含有三个串联SfvYFP的重组质粒为核苷酸序列如序列表SEQNO.17所示的pCYX006。更进一步地，本专利技术提供上述单个SfvYFP、两个串联SfvYFP或三个串联SfvYFP在莱茵衣藻中的表达，通过对含有单个SfvYFP、两个串联SfvYFP或三个串联SfvYFP质粒进行单酶切线性化反应，将含有单个SfvYFP、两个串联SfvYFP或三个串联SfvYFP的质粒转入莱茵衣藻并整合到核基因组中，挑取转化株进行藻落聚合酶链式反应(PCR，PolymeraseChainReaction)和藻落蛋白质印迹反应(WesternBlotting)，筛选得到稳定表达的阳性转化株。优选地，所述的质粒载体可以同时含有选择标记比如ble或者APHⅧ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.超折叠维纳斯黄色荧光蛋白SfvYFP，其特征在于，氨基酸序列如序列表SEQ NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.超折叠维纳斯黄色荧光蛋白SfvYFP，其特征在于，氨基酸序列如序列表SEQNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的超折叠维纳斯黄色荧光蛋白SfvYFP，其特征在于，核苷酸序列如序列表SEQNO.2所示。


3.含有单个SfvYFP、两个串联SfvYFP或三个串联SfvYFP的重组质粒。


4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述的串联为两个SfvYFP之间由两个甘氨酸GGCGGC连接。


5.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述的含有单个SfvYFP的重组质粒为核苷酸序列如序列表SEQNO.11所示的pCYX003；所述的含有两个串联SfvYFP的重组质粒为核苷酸序列如序列表SEQNO.14所示的pCYX004；所述的含有三个串联SfvYFP的重组质粒为核苷酸序列如序列表SEQNO.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢颖洪，陈颖茜，王德孚，周丽君，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32