猪细小病毒VLPs抗体检测试剂盒及其制备方法、应用技术

本发明专利技术公开了猪细小病毒VLPs抗体检测试剂盒及其制备方法、应用，其检测试剂盒包括预包被猪细小病毒VLPs的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。本发明专利技术是首次采用猪细小病毒的病毒样颗粒作为包被抗原，建立了可检测猪细小病毒的试剂盒，还试剂盒可对血清中的猪细小病毒的抗体水平进行快速检测；本发明专利技术试剂盒检测敏感性高、特异性和可重复性好，结果稳定。同时所采用的病毒样颗粒对操作者和环境安全无害、无传染性。另外本发明专利技术试剂盒应用大肠杆菌表达系统开发，因而具有经济、廉价的优点。

【技术实现步骤摘要】
猪细小病毒VLPs抗体检测试剂盒及其制备方法、应用
本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种猪细小病毒VLPsELISA抗体检测试剂盒及其制备方法、应用。
技术介绍
猪细小病毒(PorcineParvovirus，PPV)是一种耐受性极强且具有高度传染性的病毒，是导致母猪繁殖障碍的病原之一，猪细小病毒病的临床主要特征是妊娠母猪流产、胎儿死亡和木乃伊化。该病与断奶仔猪多系统衰弱综合征以及猪渗出性皮炎等疾病有关，易感成年猪如果在交配期间或者妊娠期间暴露在PPV存在的环境中，该病毒会很容易穿过胎盘屏障感染胚胎和胎儿。调查发现该病呈全球性分布，特别对妊娠母猪和仔猪危害较大，阻碍了猪养殖产业化进程，经济损失巨大。所以对于PPV的预防、诊断就显得尤为重要。病毒样颗粒(VLPs)是由病毒的衣壳蛋白形成的空心颗粒，具有和天然病毒粒子相同或相似的形态，但不含病毒遗传物质，不能自主复制，因此不会产生任何可能导致感染的遗传成分。并且衣壳蛋白组装成VLPs时，通过各亚单位之间的相互作用可以形成单个蛋白不具有的立体构象，而且可以重复并高密度的展示抗原位点。因此相对于单个病毒蛋白，使用VLPs对血清抗体检测具有更强的免疫原性和更高特异性。VLPs的天然生物学结构类似于亲本病毒颗粒，可以近乎完美的展示诱导中和抗体的抗原表位，因此免疫性强，不但能激发体液免疫反应，还可以激发细胞和粘膜免疫。VLPs具备安全、高效的特点，是未来具有广阔发展前景的候选疫苗或传递抗原的载体。目前PPV的诊断方法主要有免疫过氧化酶单层细胞实验(IPMA)、间接免疫荧光(IFA)、间接ELISA以及竞争ELISA等，但由于IPMA和IFA要求比较高，不适合大规模的PPV抗体检测。目前用于检测PPV抗体的ELISA方法大多是以灭活病毒、重组病毒、单个蛋白或多肽等作为抗原，但是以完整病毒粒子作为抗原存在安全风险，单个蛋白或多肽的免疫原性相对较差。因此，现有技术有待于进一步发展。
技术实现思路
本专利技术申请的目的在于解决现有技术的缺陷和不足，提供一种特异性强、敏感性高、稳定性好的用于猪细小病毒VLPsELISA抗体检测试剂盒及其制备方法、应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供一种猪细小病毒VLPsELISA抗体检测试剂盒，其中，包括预包被猪细小病毒VLPs的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。所述的猪细小病毒VLPsELISA抗体检测试剂盒，其中，所述猪细小病毒VLPs通过以下步骤制得：1)对猪细小病毒毒株结构蛋白VP2基因序列进行密码子优化合成，并基于优化后基因序列制备pUC-VP2重组质粒；2)利用pUC-VP2重组质粒和pSMK载体质粒构建重组质粒pSMK-VP2；3)将重组质粒pSMK-VP2转化大肠杆菌并诱导表达得到VLPs。所述的猪细小病毒VLPsELISA抗体检测试剂盒，其中，猪细小病毒毒株结构蛋白VP2基因序列进行密码子优化合成，合成后核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的猪细小病毒VLPsELISA抗体检测试剂盒，其中，利用pUC-VP2重组质粒和pSMK载体质粒构建重组质粒pSMK-VP2具体为：1)将pUC-VP2重组质粒按照如下酶切体系进行酶切：pUC-VP2质粒35μL，BsaI和BamHI各2.5μL，Cutsmartbuffer5μL，ddH2O5μL；将pSMK载体质粒按照以下体系进行酶切：pSMK载体质粒35μL，BsaI2.5μL，Cutsmartbuffer5μL，ddH2O7.5μL；上述两酶切体系通过琼脂糖凝胶电泳确认pUC-VP2重组质粒和pSMK载体质粒切开后，回收基因VP2目的片段和pSMK表达载体；2)将基因VP2目的片段和pSMK表达载体两种胶回收产物按照以下反应体系进行连接，反应体系为：VP2目的片段4μL、pSMK表达载体1μL、5μLSolutionI，混匀后16℃连接反应4h或者4℃过夜连接；3)将连接产物转化Trans5a克隆菌；4)将Trans5a克隆菌接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养16h，将过夜培养后的菌液通过全菌PCR法和酶切凝胶电泳分析，鉴定出重组质粒pSMK-VP2。5、根据权利要求4所述的猪细小病毒VLPsELISA抗体检测试剂盒，其中，所述将连接产物转化Trans5a克隆菌具体为：1)将5μL连接产物加入100μLTrans5a感受态细胞中，柔和混匀后冰浴30min；2)42℃热激90s后，立即冰浴3min；3)加入42℃预热后的LB液体培养基800μL，于37℃震荡培养1h；4)离心机4500rpm离心3min；5)弃除部分上清，留100～300μL涂布在于含有50mg/L卡那霉素的LB琼脂平板上；6)37℃恒温培养箱中倒置培养16～18h。所述的猪细小病毒VLPsELISA抗体检测试剂盒，其中，所述将过夜培养后的菌液通过全菌PCR法和酶切凝胶电泳分析，鉴定出重组质粒pSMK-VP2具体为：将过夜培养后的菌液接种于10μLPCR缓冲液体系中，利用全菌PCR法进行鉴定，将PCR反应鉴定为阳性的菌落，利用小量质粒提取试剂盒提取对应扩增菌的质粒，并进行双酶切鉴定，其双酶切体系如下：pSMK-VP2重组质粒6μL，XbaI1.5μL，XhoI1.5μL，Cutsmart1μL，37℃酶切3h，重组质粒pSMK-VP2双酶切反应结束后取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将鉴定阳性的质粒进行测序，测序结果正确的阳性质粒命名为重组质粒pSMK-VP2。所述的猪细小病毒VLPsELISA抗体检测试剂盒，其中，所述将重组质粒pSMK-VP2转化大肠杆菌并诱导表达得到VLPs具体为：1)将测序结果正确的阳性质粒转化入DE3-RIL感受态细胞，37℃恒温培养1h后，取200μL均匀涂布于含有50mg/L卡那霉素和34mg/L氯霉素的双抗性固体LB平板中，并置于37℃、220rpm恒温培养箱培养12～16h；2)挑取单个菌落于含有50mg/L卡那霉素和34mg/L氯霉素双抗性的液体培养基中，37℃培养过夜，然后以1：100的接种量转接于含50mg/mL卡那霉素和34mg/mL氯霉素的LB液体培养基，于37℃、220rpm培养至菌液OD600值在0.7左右时加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.6mM，16℃诱导表达18h左右，随后以4500rpm离心30min收集菌体沉淀；用10-20mL冰浴处理的缓冲液A重悬细菌沉淀，冰上超声破碎菌体细胞；4℃条件下，将超声裂解的菌液12000rpm离心30min，取上清液；His-SUMO-VP2蛋白通过亲和层析进行纯化，将上清液转移至由缓冲液A预平衡的镍亲和层析树脂层析柱中，4℃条件下结合1h，轻摇确保树脂与靶蛋白结合；上清液过滤两次，然后用缓冲液A洗涤蛋白，接着用缓冲液A与缓冲液B按19∶1，9∶1配成不同浓度的咪本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪细小病毒VLPs的重组蛋白，其含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪细小病毒VLPs的重组蛋白，其含有核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的核苷酸。


2.如权利要求1所示的猪细小病毒VLPs的重组蛋白，其是对猪细小病毒毒株结构蛋白VP2基因序列进行密码子优化合成，并基于优化后基因序列制备pUC-VP2重...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭慧琛，孙世琪，白满元，韩世充，董虎，宋品，魏衍全，张韵，殷宏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62