一种检测兴奋剂的玻璃蛋白质芯片制造技术

本实用新型专利技术公开了一种检测兴奋剂的玻璃蛋白质芯片，由玻璃基片和阵列式分布于基片之上的兴奋剂受体蛋白与对照的点涂层组成，其中，所述的玻璃基片是表面有醛基化修饰层的玻璃片；所述点涂层的形状为圆形，涂层区设１～２个，每涂层区的点涂层平行垂直排列成六排六列；所述点涂层包括４组２４个兴奋剂受体蛋白点涂层检测区，１组６个点涂层阳性对照区，１组６个点涂层空白对照区。本实用新型专利技术的芯片不但能区分不同类型的兴奋剂，还可以利用Ｋｉ值确定同一类型中的不同违禁药物，为大型赛事或日常训练中兴奋剂检测提供了一种敏感、经济、快捷的初筛工具。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及一种蛋白质芯片，尤其涉及一种检测兴奋剂的玻璃蛋白质芯片，属生物芯片和诊断试剂

技术介绍
兴奋剂检测作为反兴奋剂的主要手段在竞技运动中显得越来越重要，成为维护竞赛公平性、保护运动员健康的重要措施。但是，兴奋剂检测工作量大，检测一个样品往往要花费大量的时间和经费，这在很大程度上限制了对运动员的监测范围。随着科学技术的发展，新技术的应用将是有效控制兴奋剂使用的重要途径，生物芯片就是新技术之一。生物芯片是指通过微细加工技术及超分子自组装技术，在固体芯片表而构建的微分析单元和系统，具有信急含量大、操作简便、工作效率高等特点。近年来，生物芯片作为高新技术的代表之一，得到了迅速发展，技术日趋成熟，在生物检测、医学检验、疾病诊断、药物筛选和生物体内微量成分分析等方而有着十分重要的用途。目前，应用生物芯片检测兴奋剂受到了国内外专家的重视，成为研究的重要课题。应用生物芯片检测兴奋剂，采取的方法主要有以下几种类型抗体芯片，在理论上可以实现快速、高通量地检测兴奋剂，但由于兴奋剂分子量小，制备特异性的抗体成功率低、成本较高，因而研究进展不大；微流体分离芯片，即把化学分析方法，如样品分离、色谱、质谱、电泳等用微流体器件来实现，并集成在芯片中成为芯片实验室。但这种芯片技术目前尚未成熟，技术上有很大的风险，而且制备成木高，分析精度低，在实际应用中将会遇到很大的困难。经检索，有关利用药物作用原理设计的用于兴奋剂检测的受体芯片，至今未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本技术要解决的技术问题是提供一种检测兴奋剂的玻璃蛋白质芯片，该芯片是将蛋白质芯片技术与受体配基竞争结合原理相结合，用天然的受体直接检测兴奋剂。本技术的检测兴奋剂的玻璃蛋白质芯片，由玻璃基片和阵列式分布于基片之上的兴奋剂受体蛋白与对照的点涂层组成，其特征在于，所述的玻璃基片是表面有醛基化修饰层的玻璃片；所述点涂层的形状为圆形，涂层区设1～2个，每涂层区的点涂层平行垂直排列成六排六列；所述点涂层包括4组24个兴奋剂受体蛋白点涂层检测区，1组6个点涂层阳性对照区，1组6个点涂层空白对照区。其中，所述的醛基化修饰层是指在未经任何化学修饰的玻璃片裸片上覆盖有醛基化层。其中，所述的玻璃基片是长方形，面积是73mm～77mm×25mm～27mm；厚度为0.6mm～2.0mm。其中，所述的兴奋剂受体蛋白与对照及空白的点涂层的大小，可以根据点直径、点个数和点间距的变化而变化。其中，优选的实施方式是点直径为0.3mm，点间距为0.5mm，在一张玻璃基片上设置1个涂层区(如图1所示)。在上述的检测兴奋剂的玻璃蛋白质芯片中，所述点涂层中4组兴奋剂受体蛋白主要针对以下几类直接作用于受体的兴奋剂(1)作用于阿片受体的兴奋剂主要是镇痛剂，如吗啡、度冷丁等。这些化合物与吗啡的受体均具有较强的亲和力，在体外能够与受体形成复合物。(2)作用于肾上腺素受体的兴奋剂主要有作用于β受体的拮抗剂，日前常用的药物有9种；如心得安、心得宁、心得平等。作用于α受体的激动剂，主要是部分刺激剂类的兴奋剂。(3)作用于性激素受体的兴奋剂主要为合成类固醇，亦叫同化激素。最常用的有大力补、康力龙、苯丙酸诺龙、癸酸诺龙等。(4)作用于离子通道的兴奋剂主要是利尿剂，此类药物有稀释尿液的功能。另有部分兴奋剂分别作用与其他不同的受体，如红细胞生长素受体(EPO受体)。进一步优选的受体蛋白类型及其对应检测兴奋剂类别是雄激素受体、雌激素受体促蛋白合成类固醇；Cotransporter刺激剂；肾上腺素beta受体Beta-2激动剂；离子通道类受体利尿剂和掩盖剂；EPO受体、胰岛素受体肽类激素、模拟剂及类似物；opioid镇痛剂。在上述的检测兴奋剂的玻璃蛋白质芯片中，所述点涂层中的阳性对照针对检测兴奋剂的类别以常规方法选择，空白对照同样对应检测兴奋剂的类别以常规方法选择。由于本技术所述蛋白质芯片的实际耗用量极微，上述大部分受体可以通过购买商业化的产品解决，个别尚无产品的受体可实验室自行制备，主要步骤如下1)获取纯化的受体蛋白，并对其氨基酸序列进行分析。2)以此合成特定的受体cDNA；也可直接从细胞中制备或纯化受体的mRNA.以所得的mRNA在逆转录酶的作用下得到其cDNA。或直接合成。3)将所获得的cDNA进行亚克隆.以获得大量的扩增模板。4)将克隆的重组DNA分子导入真核细胞.如哺乳动物细胞.酵母.昆虫细胞等.常用的方法有磷酸钙转染、电穿孔、脂质体转染、DEAD葡聚糖介导转染及显微注射等。5)实现细胞稳定转染.获得表达的蛋白并纯化。6)对重组蛋白进行鉴定和活性检测。本技术所述检测兴奋剂的玻璃蛋白质芯片的理论基础——受体结合理论根据兴奋剂的性质和特点，在实际上能够特异性地识别兴奋剂的生物物质中，受体蛋白是最具特点的可利用物质。特别是随着分子生物学技术的发展，使用基因工程技术可以获得与人受体相同的重组蛋白，使受体蛋白芯片技术易于实施。受体与配基结合的特点主要有特异性高，是体内识别特殊物质的(激素或递质)特殊蛋白质；亲和力与生物活性密切相关，凡是具有生物活性的物质，必然与受体结合，可以从根本上检测同类药物的使用。本技术所述检测兴奋剂的玻璃蛋白质芯片的设计原理是将受体蛋白保持活性的固定在玻璃体表面，将配基标记上荧光物质，然后将荧光标记的配基与待测样品(无标记配基)共同与受体反应。荧光标记的配基与受体结合的量随着样品中所含兴奋剂浓度的上升而降低，这样根据芯片点阵结合标记配基的荧光强度即可计算出样品中所含兴奋剂的浓度。上述标记配基较为普遍采用的是荧光探针，受体特异性荧光探针是指可选择性与受体分子相结合的含有荧光基团的小分子化合物。其共同特点是1)对受体功能影响较小；2)高度特异性；如探针与受体的结合既有高度特异性，又有高度亲和性；3)敏感性及分辨力高。与纯化的受体相同，日前大部分受体对应的荧光标记配基都已商品化，可以通过商业化的公司购得。本技术所述检测兴奋剂的玻璃蛋白质芯片不但能定性的测量阳性反应，而且能够定量的测出尿样中的含量，同时荧光配体的引入避免了放射污染，高通量、低消耗有利少推广。更重要的是，生物检测法是从根本上杜绝兴奋剂的使用。从药理学上讲，尽管新型兴奋剂结构类似物千变万化层出不穷，但要发挥其作用却只有一个途径，就是要与其体内特异的靶向受体结合。而受体芯片正是将其靶向受体及其亚型固定于芯片上，利用芯片高灵敏度的特点对尿样中的违禁药物分子进行捕捉，这样即便受检者服用了新型药品，尽管无法立刻确定其结构，但只要其发挥兴奋剂样药理作用，就能被检测到。检测结果表明该方法具有灵敏度较高，操作简便，检测范围广泛的特点。总之，本技术涉及的检测兴奋剂的玻璃蛋白质芯片可用于各类兴奋剂的检测和类别鉴定，能够实现对禁用药物的微量多种样品进行简便快捷的初筛，可疑样品可进一步检测，阴性样品直接排除。并且，利用本技术涉及的芯片对尿样进行检测，将大大缩短前处理时间，增加检测数量，降低成本，缩短总体检测时间，具有诱人的应用前景，有望满足日前国际奥委会开列的名单达140多种，且年年递增的禁用药物检测的需要。附图说明图1本技术所述检测兴奋剂的玻璃蛋白质芯片的直观图，其中，1为玻璃基片；2为涂层本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测兴奋剂的玻璃蛋白质芯片，由玻璃基片和阵列式分布于基片之上的兴奋剂受体蛋白与对照的点涂层组成，其特征在于，所述的玻璃基片是表面有醛基化修饰层的玻璃片；所述点涂层的形状为圆形，涂层区设１～２个，每涂层区的点涂层平行垂直排列成六排六列；所述点涂层包括４组２４个兴奋剂受体蛋白点涂层检测区，１组６个点涂层阳性对照区，１组６个点涂层空白对照区。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：常宏文，赵海霞，马剑峰，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：实用新型
国别省市：88[中国|济南]