一种用于创面治疗的早期组织工程皮肤及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于创面治疗的早期组织工程皮肤。研究发现：皮肤干细胞构建的短期培养的双层组织工程皮肤含有更多的活性细胞，凋亡通路激活较少，移植后的皮肤结构更好，还有皮脂腺和毛囊产生。研究表明，短期培养的双层组织工程皮肤在体内移植后能产生更好的皮肤结构，临床上可能有利于伤口更好的愈合。另外，短期培养的组织工程皮肤可大大缩短制备时间及成本，本研究为其临床应用提供了充分的理论及研究依据。

【技术实现步骤摘要】
一种用于创面治疗的早期组织工程皮肤及其制备方法
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种用于创面治疗的早期组织工程皮肤。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。由于事故、疾病、慢性伤口、急性创伤、烧伤等造成的皮肤损伤会损害皮肤屏障，严重的可能导致伤者永久残疾或死亡。皮肤移植是治疗大面积创面最有希望的方法，然而对于严重烧伤的病人来说，自体来源的皮肤非常有限，自体移植并不是最优的治疗选择。对于同种异体移植，外来组织还存在着潜在的免疫排斥问题。组织工程在20世纪80年代末正式引入后，在急性和慢性皮肤创伤的治疗中，组织工程皮肤替代物的使用为患者带来了新希望。制备组织工程皮肤的常用方法是在可生物降解的支架上植入细胞，包括表皮角质形成细胞、真皮成纤维细胞和/或干细胞。近几十年来，人类组织工程皮肤已经从简单的表皮替代物发展到具有表皮和真皮双层结构的复杂全层皮肤。自体细胞来源构建的双层组织工程皮肤非常适用于临床，因为它不仅包含皮肤的全层结构，在移植后还可形成永久性的融合而无免疫排斥反应。然而，目前组织工程皮肤在应用和治疗上仍然存在诸多局限性：一方面，再生具有完整功能(保护、调节和感觉)的皮肤完全仍然具有挑战性。目前组织工程皮肤已经能够通过条件控制达到皮肤附件的再生，包括毛细血管网络、感觉神经支配、脂肪组织和色素生成，尽管如此，仍然无法完全重建完整的皮肤功能，尤其是功能性的毛囊和汗腺的再生。培养细胞无法在体外再生毛囊的重要原因是在培养过程中细胞失去了毛原性。对于再生医学研究来说，开发一个最佳的系统来维持细胞在体外的再生能力至关重要。另一方面，全层组织工程皮肤的构建需要培养大量的不同类型的细胞，培养过程复杂且耗时。专利技术人发现：使用以往的技术构建双层组织工程皮肤时，表皮和真皮细胞通常需要2到4周的扩增培养才能获得足够的数量，构建组织工程皮肤基本结构后还需要再培养3周或更长时间。在临床治疗中，耗时是组织工程皮肤应用的主要限制因素。
技术实现思路
为了克服上述问题，本专利技术提供了一种用于创面治疗的短期培养的组织工程皮肤，移植后采用本技术短期培养的双层组织工程皮肤(下称早期组织工程皮肤)较长期培养的组织工程皮肤(下称晚期组织工程皮肤)移植效果更好。研究发现：早期和晚期组织工程皮肤移植后均形成了正常结构的层状表皮，但早期组织工程皮肤形成的表皮中增殖标记物Ki-67和表皮干细胞标记物p63水平较高。早期组织工程皮肤的移植不仅真皮厚度更大、真皮细胞密度更大，且新生血管数量更多，而且只在早期组织工程皮肤移植后形成的皮肤中观察到了毛囊的形成。与晚期组织工程皮肤相比，早期组织工程皮肤表达高水平p63，但参与激活凋亡途径的基因表达水平较低。为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个方面，提供了早期组织工程皮肤在创面治疗中的应用，所述早期组织工程皮肤的培养时间为5～9天。本专利技术研究发现：皮肤干细胞构建的早期双层组织工程皮肤含有更多的活性细胞，凋亡通路激活较少，移植后的皮肤结构更好，还有皮脂腺和毛囊产生。研究表明，短期培养的双层组织工程皮肤在体内移植后能产生更好的皮肤结构，临床上可能有利于伤口更好的愈合。另外，短期培养的组织工程皮肤可大大缩短制备时间及成本，本研究为其临床应用提供了充分的理论及研究依据。本专利技术的第二个方面，提供了一种早期组织工程皮肤，所述早期组织工程皮肤的培养时间为5～9天。本专利技术缩短了双层组织工程皮肤构建所需的培养时间，在短时间内制备出功能完善的组织工程皮肤，对其临床应用具有重要意义。本专利技术的第三个方面，提供了一种早期组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，包括：制备无细胞胶原层；在脱细胞胶原层的上方构建含有真皮干细胞的胶原基质；建立表皮细胞层；将组织工程皮肤培养5～9天。上述方法能够简单快速地分离人皮肤表皮细胞和真皮干细胞，缩短了皮肤干细胞扩增所需的培养时间，而且这些人体皮肤细胞在培养体系中扩增后，仍然保持着它们产生带有毛囊的全层皮肤的潜力。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术研究发现：移植后早期双层组织工程皮肤移植效果较好。早期和晚期组织工程皮肤的移植后均形成了正常结构的层状表皮，但早期组织工程皮肤形成的表皮中增殖标记物Ki-67和表皮干细胞标记物p63水平较高。早期组织工程皮肤的移植不仅真皮厚度更大、真皮细胞密度更大，且新生血管数量更多，而且只在早期组织工程皮肤移植后的皮肤中观察到了毛囊的形成。与晚期组织工程皮肤相比，早期组织工程皮肤表达高水平p63，但参与激活凋亡途径的基因表达水平较低。(2)本专利技术的培养时间短(培养时间为5～9天)、方法简单、实用性强，易于推广。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为本专利技术实施例1中早期和晚期组织工程皮肤的制备流程。a，在六孔板的transwell中建立一个无细胞胶原层。b，在脱细胞胶原层的上方构建含有真皮干细胞的胶原基质。c，在培养箱中培养4天，胶原基质发生收缩。d，基质在第4天收缩完成且稳定后，将成人表皮干细胞添加到基质上层。e，向每个小室内添加表皮化培养基。每2天更换一次培养基，直到第11天。f，从第12天起，改为气液界面表皮化培养基：小室外加培养基，小室内部保持干燥。在培养过程中的四个不同时间点收集组织工程皮肤，其中5天组和9天组为早期组织工程皮肤组，14天组和21组为晚期组织工程皮肤组。图2为本专利技术实施例1中早期和晚期组织工程皮肤移植后新形成的皮肤的整体效果。移植成功的区域显示出明显的色素沉着，白色虚线表示宿主小鼠皮肤和着色的人类移植皮肤区域的边界，早期组织工程皮肤在移植后能够比晚期移植产生更大的色素沉着区域。bar＝5mm，*p<0.05，**p<0.01，n＝3。图3为本专利技术实施例1中早期和晚期组织工程皮肤移植后新形成的皮肤的表皮层情况对比。所有组均能形成正常表皮结构，但与晚期组织工程皮肤相比，早期组织工程皮肤移植后形成的表皮中有更多Ki-67和p63阳性表达的细胞。bar＝50μm，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n＝3。图4为本专利技术实施例1中早期和晚期组织工程皮肤移植后新形成的皮肤的真皮层、血管及附属物情况对比。组织工程皮肤早期移植组形成的真皮厚度大于晚期组，真皮成纤维细胞密度较高，形成的真皮微血管数量多于晚期组。只在早期组织工程皮肤的移植组中观察到了成熟毛囊和皮脂腺的形成。bar＝50μm，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n＝3。图5为本专利技术实施例1中早期和晚期组织工程皮肤移植前蛋白表达及分子水平的差异。与其他组相比，组织工程皮肤5天组表达了最高水平的p63，随着体外培养时间的延本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.早期组织工程皮肤在创面治疗中的应用，其特征在于，所述早期组织工程皮肤的培养时间为5～9天。/n

【技术特征摘要】
1.早期组织工程皮肤在创面治疗中的应用，其特征在于，所述早期组织工程皮肤的培养时间为5～9天。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述早期组织工程皮肤为双层组织工程皮肤。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述双层组织工程皮肤包括：胶原层和表皮层。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述胶原层包括：无细胞胶原层和真皮细胞胶原层。


5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述早期组织工程皮肤的制备方法如下：
制备无细胞胶原层；
在脱细胞胶原层的上方构建含有真皮干细胞的胶原基质；
建立表皮细胞层；
将组织工程皮肤培养5～9天。


6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述制备无细胞胶原层的具体步骤为：将MEM、牛I型胶原、FBS、L-谷氨酰胺和DMEM混合，然后将pH值调整到7.2～7.3，混匀，形成混合物；
在培养板中加入所述混合物，在37～37.5℃，5～5.5％的CO2培养箱中培养，使混合物凝胶。

【专利技术属性】
技术研发人员：吴训伟，张群，白福响，温洁，冷雪，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37