一种F基因型腮腺炎减毒活疫苗的规模化制备方法技术

本发明专利技术公开了一种F基因型腮腺炎减毒活疫苗的规模化制备方法。包括KMB‑17细胞的传代与计数、病毒收获液制备、疫苗原液制备、疫苗半成品、成品制备。本发明专利技术首创在细胞工厂中，以人二倍体细胞为基质规模化制备F基因型腮腺炎病毒减毒活疫苗，在保证疫苗安全性和质量稳定性的同时，还能降低生产成本，节约生产时间。与传统的罗氏瓶培养相比，本发明专利技术所需毒种量较小，每批次仅需60～84mL毒种即可获得60000人份的疫苗成品，具有产量大、成本低、质量稳定等优点，对于预防和控制我国流行性腮腺炎的感染和传播具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种F基因型腮腺炎减毒活疫苗的规模化制备方法
本专利技术属于抗病毒疫苗制备
，具体是涉及一种以细胞工厂为培养容器，并利用人二倍体细胞(KMB-17株)进行适应性传代培养生长，进而实现规模化制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法。
技术介绍
腮腺炎病毒(mumpsvirus，MuV)是引起流行性腮腺炎的病原体。腮腺炎病毒属于副黏病毒科，基因组为不分节段的单负链核糖核酸(RNA)，含有大约15500个核苷酸，在两端序列之间按3′-NP-P-M-F-SH-HN-L-5′的顺序排列着编码7种病毒蛋白的基因。其中，SH基因的变异程度是最大的，因此一般选用SH基因作为分型依据。依据SH抗原上核苷酸的差异，腮腺炎病毒可分为A-L共12个基因型。我国作为一个大量使用腮腺炎减毒活疫苗的地区，但其疫苗毒株除来自国外的成品苗外，主要使用国际通用Jeryl-Lynn株培育得到的S79株，病毒基因型均属于国外流行的A基因型。随着近年来国内在腮腺炎流行毒株方面的分子流行病学分析的深入，目前在我国流行的腮腺炎病毒株主要为F基因型。国内外的研究资料表明，虽然不同基因型的腮腺炎减毒活疫苗可针对其它基因型别的腮腺炎病毒产生交叉性抗原保护作用，但这种基因型之间的抗原交叉性是有限的，有时可表现为不能抵抗其它基因型别病毒的感染，从而再次感染腮腺炎病毒。同时，在许多针对该疫苗使用后副反应的分析资料及该病毒的流行病学资料亦提示，某些毒株和基因型具有神经毒性，例如，已报道的资料表明C、D、G、H、I、J基因型具有明确的神经毒性，但F基因型至今尚无报道涉及其神经毒性。因此，从这两个意义上看，针对我国目前腮腺炎流行发病率仍然属于丙类传染病前列的实际情况，分离及研究开发具有主要流行倾向、并具有较好免疫原性的F基因型减毒疫苗毒株，具有重要的现实意义。同时，目前常规使用的S79株及Jeryl-Lynn株减毒活疫苗均是在鸡胚细胞上制备的，在使用过程中，有引起由于异源性细胞基质所带来过敏反应等副作用的可能。无论从理论上还是应用上看，使用人源性细胞基质的人二倍体细胞进行适应性传代培养生长而制备的腮腺炎减毒株，可以避免采用鸡胚细胞作为细胞基质可能带来的危害，将具有更实际的应用价值。针对上述问题，本申请人已经有过关于《F基因型腮腺炎减毒毒种及其用途》和《一种F基因型腮腺炎减毒活疫苗及其制备方法和应用》的专利申请。前者，主要涉及的是减毒毒种的研究，包括了毒种的制备、毒种减毒性状的观察、毒种免疫原性的分析、安全性分析及种子库的建立。通过收集发生在云南省红河州石屏县牛街镇他腊希望小学学生群体中的腮腺炎患儿咽漱液，采用Vero细胞从腮腺炎患儿咽漱液标本中分离腮腺炎病毒，经RT-PCR方法全基因测序后，明确其为当前流行基因型——F基因型。之后将该分离毒种适应于人二倍体细胞(KMB-17株)并进行蚀斑克隆及减毒传代，得到F基因型腮腺炎减毒毒种——SP-A株。并按国家及WHO相关规程要求对其进行了全面的检定，明确SP-A株具备普通腮腺炎减毒毒种的安全性，并且具有较好的免疫原性。该毒种已与2010年01月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，分类命名为腮腺炎病毒，保藏编号为CGMCC№.3579。之后又进一步针对该毒种进行了F基因型腮腺炎减毒活疫苗制备工艺的研究，但尚未实现疫苗的规模化生产。细胞工厂作为一种新型的培养容器，较以往的培养容器具有操作便捷、使用安全、产量高、占用空间少、可控性好、可有效降低污染等优点，且操作方式既优于转瓶，又无生物反应器等类似设备的应用限制，已成为较成熟的新一代细胞培养技术。但现有技术中尚未见有同时利用细胞工厂和人二倍体细胞，实现F基因型腮腺炎减毒活疫苗规模化制备的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种工艺简便、疫苗质量稳定、安全性高、每批次产量大的F基因型腮腺炎减毒活疫苗规模化制备方法。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现。除非另有说明，本专利技术所采用的百分数均为质量百分数。一种F基因型腮腺炎减毒活疫苗的规模化制备方法，包括以下步骤：(1)配制所需的各种试剂和溶液备用：MEM培养基：每1000mLMEM培养基含9.4gMEM干粉；MEM培养液：每1000mLMEM培养液含有6.6％NaHCO330mL，3％谷氨酰胺20mL，新生牛血清100mL和MEM培养基850mL；MEM维持液：每1000mLMEM维持液含有6.6％NaHCO340mL，3％谷氨酰胺20mL和MEM培养基940mL；PBS溶液：每1000mLPBS溶液中含有：NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H202.87g和KH2PO40.2g，以注射用水定容至1000mL，pH为7.3～7.5；胰蛋白酶消化液：每1000mL胰蛋白酶消化液含有1％NaOH2.5mL，4％EDTA·2Na3.5mL,1％胰蛋白酶125mL和PBS溶液869mL；冻干保护剂：每1000mL冻干保护剂含有：蔗糖80g、海藻糖80g、甘氨酸20g、右旋糖酐20g、人白蛋白10ml、精氨酸2g和谷氨酸钠1g，以注射用水定容至1000mL；(2)KMB-17细胞的传代与计数：取复苏好的KMB-17细胞加入胰蛋白酶消化液消化细胞，然后加入预温到37℃的MEM培养液，转入细胞工厂传代培养，在37℃培养4～5d，挑选无污染且生长状态良好的细胞工厂进行计数，细胞总数应不低于3.75×108/细胞工厂；(3)病毒收获液的制备：弃去细胞工厂中的旧培养液，然后清洗细胞：每个细胞工厂加入1000mLPBS溶液，轻轻摇晃4～6次，弃去洗液；浸泡细胞：每个细胞工厂加入1000mLPBS溶液，浸泡10min，弃去洗液；再重复上述清洗与浸泡操作各一次；然后在每个细胞工厂中加入1500mL预温至37℃的MEM维持液，按照MOI值0.020接种F基因型腮腺炎病毒毒种，置于37℃培养7～9d，收集上清液即为病毒收获液；(4)疫苗原液制备：病毒收获液经50μm滤器和10μm滤器顺序过滤后，得到疫苗原液；(5)疫苗半成品制备：在疫苗原液中加入等量冻干保护剂，混匀后得到疫苗半成品；(6)疫苗成品制备：疫苗半成品再经分装、冻干后得到病毒含量不低于4.30lgCCID50/mL的F基因型腮腺炎减毒活疫苗成品。步骤(2)所述的转入细胞工厂传代培养按照下述流程进行：1个培养瓶→4个培养瓶→16个培养瓶→2个细胞工厂→4个细胞工厂→12个细胞工厂。步骤(6)所述的冻干操作具体为：制冷控制(降温至5℃保持60min，然后快速制冷至-32℃，保持180min)、抽真空降压(压力降至0.35mbar)、一次干燥(升温至-28℃，压力降至0.02mbar)、解吸干燥(升温至28℃，压力降至0.01mbar)、压力升高不超过0.03mbar进行压塞，再充气至常压时可结束冻干；整个冻干工艺时长为66～70h，在冻干过程中温度达到稳定状态后，温度波动范围不超过±2.0℃。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种F基因型腮腺炎减毒活疫苗的规模化制备方法，包括以下步骤：/n(1)配制所需的各种试剂和溶液备用：/nMEM培养基：每1000mL MEM培养基含9.4g MEM干粉；/nMEM培养液：每1000mL MEM培养液含有6.6％NaHCO

【技术特征摘要】
1.一种F基因型腮腺炎减毒活疫苗的规模化制备方法，包括以下步骤：
(1)配制所需的各种试剂和溶液备用：
MEM培养基：每1000mLMEM培养基含9.4gMEM干粉；
MEM培养液：每1000mLMEM培养液含有6.6％NaHCO330mL，3％谷氨酰胺20mL，新生牛血清100mL和MEM培养基850mL；
MEM维持液：每1000mLMEM维持液含有6.6％NaHCO340mL，3％谷氨酰胺20mL和MEM培养基940mL；
PBS溶液：每1000mLPBS溶液中含有：NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H202.87g和KH2PO40.2g，以注射用水定容至1000mL，pH为7.3～7.5；
胰蛋白酶消化液：每1000mL胰蛋白酶消化液含有1％NaOH2.5mL，4％EDTA·2Na3.5mL,1％胰蛋白酶125mL和PBS溶液869mL；
冻干保护剂：每1000mL冻干保护剂含有：蔗糖80g、海藻糖80g、甘氨酸20g、右旋糖酐20g、人白蛋白10ml、精氨酸2g和谷氨酸钠1g，以注射用水定容至1000mL；
(2)KMB-17细胞的传代与计数：取复苏好的KMB-17细胞加入胰蛋白酶消化液消化细胞，然后加入预温到37℃的MEM培养液，转入细胞工厂传代培养，在37℃培养4～5d，挑选无污染且生长状态良好的细胞工厂进行计数，细胞总数应不低于3.75×108/细胞工厂；
(3)病毒收获液的制备：弃去细胞工厂中的旧培养液，然后清洗细胞：每个细胞工厂加入1000mLPBS...

【专利技术属性】
技术研发人员：李琦涵，王晶晶，刘龙丁，车艳春，李卫东，梁燕，王微，张莹，杨伟，邱恒，杨振清，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53