一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型及其构建方法与应用，所述癫痫持续状态疾病动物模型为小鼠脑内核团(模型一海马CA1区和丘脑腹前核VA区；模型二基底外侧杏仁核BLA区和丘脑腹前核VA区)脑立体定位病毒(化学遗传病毒rAAV‑CaMKIIa‑hM3D(Gq)‑mCherry‑WPREs‑pA)注射和小鼠海马CA3区电极阵列埋置，小鼠恢复1周后，腹腔注射氯氮平的代谢产物CNO，使得CNO与病毒表达的受体结合从而激活神经元诱导癫痫持续状态发作，经行为学观察和在体多通道局部场电位记录判断得到癫痫持续状态疾病动物模型。本发明专利技术所构建的癫痫持续状态疾病动物模型发作持续时间稳定、成功率高、死亡率低、重复性好，在研究癫痫持续状态的起源、形成机制、耐药性癫痫持续状态药物的筛选及机制方面具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型及其构建方法与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型及其构建方法与应用。
技术介绍
目前用于癫痫持续状态研究的动物模型几乎都是利用外来化学毒物或电刺激建立起来的，而这些毒物和极端的电刺激在人或动物体内并不存在，也不是癫痫持续状态已知的病因，参与活动的神经元、起始和终止的核团以及部位在这些动物模型中也不清楚，因而人们很难通过这种动物模型来了解人类癫痫持续状态的“真实世界”。传统的癫痫持续状态动物模型主要通过腹腔或颅内注射化学药物，使得大量神经元过度兴奋，产生兴奋性毒性作用，从而诱发出癫痫持续状态。最为经典的模型是pilocarpine腹腔注射，此外，还有海人酸腹腔注射和颅内注射等。这些模型都能很好的诱导产生癫痫持续状态，但是在实际应用中很容易发现这些模型的成功率低、死亡率高，无法明确癫痫持续状态的病灶起源，而且由于诱导过程中产生的兴奋性毒性导致的大量神经元的死亡，使得这些模型小鼠无法重复使用，也无法在同一只小鼠身上进行前后的对照实验。随着现代科学研究对研究精度的要求的提高，我们急需能够明确知道病灶起源、能够重复利用、能够进行前后对照实验的癫痫持续状态疾病模型。
技术实现思路
本发第一目的在于提供一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型。本发第二目的在于提供一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法。本发第三目的在于提供一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法构建的动物模型在研究癫痫持续状态的起源、癫痫持续状态的形成机制、耐药性癫痫持续状态药物的筛选及机制中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法，具体步骤如下：1)对待建模型进行病毒注射；2)对步骤1)处理后的模型埋置电极阵列；3)诱发步骤2)处理后的模型进入癫痫持续状态，并进行行为学观察与在体多通道局部场电位记录；4)判定化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型是否构建成功。进一步，步骤1)中所述对待建模型进行病毒注射的具体步骤如下：1-1)术前常规处理：选取了24只6-8周龄C57小鼠，分为模型一和模型二各12只。其中模型一和模型二相互独立，C57小鼠用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定在脑立体定位器上，并给C57小鼠垫上加热垫使小鼠体温保持在35-37℃，用眼药膏涂抹眼睛，剪去头顶毛发，在体式显微镜下剪开头皮，用棉签擦拭颅骨表面，暴露出前后囟及正中十字缝；1-2)颅骨调平：将颅骨钻固定在脑立体定位器上，调节钻头至C57小鼠的前囟并以此为坐标原点，然后以原点左右±2.0mm，原点与后4.2mm为参考点调平颅骨平面；1-3)钻孔：将颅骨钻头调至坐标原点，用颅骨钻在定位目标团的表面钻孔至暴露脑膜无出血，再用洗耳球吹走颅骨碎屑，并用细针挑破脑膜，暴露出脑组织；1-4)注射病毒：取下颅骨钻，用微量注射泵吸取100nl病毒，病毒滴度：5.04E+12vg/mL，将微量注射泵装在立体定位器上，并调至原点后定位至目标核团颅骨表面并缓慢插入至目标核团深度，微量注射泵注射速度为20nl/min，注射完成后留置10min，防止病毒倒流吸收不充分，最后缓慢退出注射泵，并以同样的方法注射其他核团。全部核团注射完毕后，缝合头皮，做好标记，放回原位代养3周。进一步，步骤1-1)中模型一为海马CA1区(1.5，2.0，1.4)和丘脑腹前核VA区(1.25，0.94，3.75)，模型二为基底外侧杏仁核BLA区(3.0，2.0，4.6)和丘脑腹前核VA区(1.25，0.94，3.75)；步骤1-3)中定位颅骨表面钻孔位置坐标为：模型一坐标为海马CA1区(AP，1.5；ML，2.0；DV，0)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，0)，模型二为基底外侧杏仁核BLA区(AP，3.0；ML，2.0；DV，0)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，0)；步骤1-4)中病毒为化学遗传病毒(rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA)，目标核团颅骨表面及插入深度的坐标为：模型一的海马CA1区(AP，1.5；ML，2.0；DV，1.4)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，3.75)，模型二的基底外侧杏仁核BLA区(AP，3.0；ML，2.0；DV，4.6)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，3.75)。进一步，步骤2)中所述对步骤1)处理后的模型埋置电极阵列的具体步骤如下：2-1)术前常规处理：取步骤1-4)处理后的小鼠模型用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定在脑立体定位器上，并给小鼠模型垫上加热垫使小鼠模型体温保持在35-37℃，用眼药膏涂抹眼睛，剪去头顶毛发，在体式显微镜下剪开头皮，用棉签擦拭颅骨表面，暴露出前后囟及正中十字缝；2-2)颅骨调平：将颅骨钻固定在脑立体定位器上，调节钻头至小鼠模型的前囟并以此为坐标原点，然后以原点左右±2.0mm，原点与后4.2mm为参考点调平颅骨平面；2-3)钻孔：将颅骨钻头调至坐标原点，先用颅骨钻在小鼠模型的待检测局部场电位的核团钻孔至暴露脑膜无出血，再用洗耳球吹走颅骨碎屑，并用细针挑破脑膜，暴露出脑组织，然后在颅骨适当位置钻一个不钻穿颅骨的小孔I，在额叶两侧颅骨表面分别钻开同样大小的小孔II和小孔III；2-4)电极埋置：取下颅骨钻，将微电极安装在脑立体定位器上，重新调回原点后定位至小鼠模型的待检测局部场电位的核团坐标位置并缓慢插入至目标核团所在深度，然后将一个1.4×2.6mm规格的小螺丝钉拧入小孔I作为固定螺丝，防止后续实验过程中电极脱落，将两颗1.4×6mm规格的小螺丝钉分别拧入小孔II和小孔III作为参考电极，在电极周围和螺丝周围涂上牙科水泥固定好电极和螺丝，待牙科水泥凝固后取下小鼠模型，做好标记，放回原位代养1周。进一步，步骤2-4)中待检测局部场电位的核团坐标位置及目标核团所在深度的坐标为海马CA3(AP，2.3；ML，2.0；DV，2.1)。进一步，步骤3)中所述诱发步骤2)处理后的模型进入癫痫持续状态，并进行行为学观察与在体多通道局部场电位记录的具体步骤如下：取步骤2-4)中病毒表达完成，埋步骤1-4)中病毒为化学遗传病毒(rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA)，目标核团颅骨表面及插入深度的坐标为：模型一的海马CA1区(AP，1.5；ML，2.0；DV，1.4)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，3.75)，模型二的基底外侧杏仁核BLA区(AP，3.0；ML，2.0；DV，4.6)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，3.75)。进一步，步骤2)中所述对步骤1)处理后的模型埋置电极阵列的具体步骤如下：2-1)术前常规处理：取步骤1-4)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：/n1)对待建模型进行病毒注射；/n2)对步骤1)处理后的模型埋置电极阵列；/n3)诱发步骤2)处理后的模型进入癫痫持续状态，并进行行为学观察与在体多通道局部场电位记录；/n4)判定化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型是否构建成功。/n

【技术特征摘要】
1.一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)对待建模型进行病毒注射；
2)对步骤1)处理后的模型埋置电极阵列；
3)诱发步骤2)处理后的模型进入癫痫持续状态，并进行行为学观察与在体多通道局部场电位记录；
4)判定化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型是否构建成功。


2.如权利要求1所述的一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述对待建模型进行病毒注射的具体步骤如下：
1-1)术前常规处理：选取了24只6-8周龄C57小鼠，分为模型一和模型二各12只。其中模型一和模型二相互独立，C57小鼠用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定在脑立体定位器上，并给C57小鼠垫上加热垫使小鼠体温保持在35-37℃，用眼药膏涂抹眼睛，剪去头顶毛发，在体式显微镜下剪开头皮，用棉签擦拭颅骨表面，暴露出前后囟及正中十字缝；
1-2)颅骨调平：将颅骨钻固定在脑立体定位器上，调节钻头至C57小鼠的前囟并以此为坐标原点，然后以原点左右±2.0mm，原点与后4.2mm为参考点调平颅骨平面；
1-3)钻孔：将颅骨钻头调至坐标原点，用颅骨钻在定位目标团的表面钻孔至暴露脑膜无出血，再用洗耳球吹走颅骨碎屑，并用细针挑破脑膜，暴露出脑组织；
1-4)注射病毒：取下颅骨钻，用微量注射泵吸取100nl病毒，病毒滴度：5.04E+12vg/mL，将微量注射泵装在立体定位器上，并调至原点后定位至目标核团颅骨表面并缓慢插入至目标核团深度，微量注射泵注射速度为20nl/min，注射完成后留置10min，防止病毒倒流吸收不充分，最后缓慢退出注射泵，并以同样的方法注射其他核团。全部核团注射完毕后，缝合头皮，做好标记，放回原位代养3周。


3.如权利要求2所述的一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法，其特征在于，
步骤1-1)中模型一为海马CA1区(1.5，2.0，1.4)和丘脑腹前核VA区(1.25，0.94，3.75)，模型二为基底外侧杏仁核BLA区(3.0，2.0，4.6)和丘脑腹前核VA区(1.25，0.94，3.75)：
步骤1-3)中定位颅骨表面钻孔位置坐标为：模型一坐标为海马CA1区(AP，1.5；ML，2.0；DV，0)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，0)，模型二为基底外侧杏仁核BLA区(AP，3.0；ML，2.0；DV，0)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，0)；
步骤1-4)中病毒为化学遗传病毒(rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA)，目标核团颅骨表面及插入深度的坐标为：模型一的海马CA1区(AP，1.5；ML，2.0；DV，1.4)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，3.75)，模型二的基底外侧杏仁核BLA区(AP，3.0；ML，2.0；DV，4.6)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，3.75)。


4.如权利要求2所述的一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法，其特征在于，步骤2)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：王学峰，贺淼清，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50