一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法技术

本发明专利技术涉及一种生育力保护保存技术。技术方案是：一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法；依照以下步骤进行：1)卵巢组织冷冻：先在基础液、平衡液、冷冻液中分别加入褪黑素，使褪黑素浓度达到0.01mM；接着将取自人体的卵巢组织依次经基础液、平衡液、冷冻液中分别进行浸没处理5‑20分钟后，再分别装入冷冻管内密封直接投入液氮中冷冻保存；2)卵巢组织的解冻：先在1mol/L的蔗糖液、0.5mol/L的蔗糖液以及0.25mol/L的蔗糖液中分别加入褪黑素，获得褪黑素浓度为0.01mM的三种复苏液，而后进行37℃预热。该方法应具有可减少解冻后卵巢组织中颗粒细胞凋亡、提高卵巢组织玻璃化冷冻的效率的特点。

A method to improve the efficiency of vitrification of ovarian tissue

【技术实现步骤摘要】
一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法
本专利技术涉及一种生育力保护保存技术，具体涉及一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法。
技术介绍
随着恶性肿瘤发病率逐年增加、发病年龄逐渐年轻化以及推迟生育年龄等个人原因，对生育力保存的需求急剧增加。保持女性生育力方法主要有胚胎冷冻、卵子冷冻及卵巢组织冷冻。卵巢冻存在生育力保存方面有其独特优势，如可保存青春期前女性患者的生育功能、可随时进行而不会延迟肿瘤本身的治疗、可保存诸如乳腺癌等激素敏感性肿瘤患者的生育功能、维持女性性腺内分泌功能等。2004年，Donnez等报告了通过卵巢组织冷冻保存和移植获得的第1个婴儿，是人类生殖医学的里程碑。截至2017年6月，全世界报道的活产婴儿数量已经超过130个，并且在2016～2017年呈对数增长，可见卵巢冷冻移植技术具有临床应用可行性，但是仍然存在移植后妊娠率低的问题。颗粒细胞的增殖与分化既是始基卵泡生长启动的重要前提，又为生长期卵泡的进一步发育成熟提供必要的营养与信息支持，在正常卵巢的周期性卵泡发育过程中，各期卵泡的闭锁与颗粒细胞凋亡密切相关。玻璃化冻融过程对卵泡内颗粒细胞损伤较大，推测颗粒细胞损伤可能是冷冻过程中卵泡损伤的关键因素。因此优化卵巢组织冻存、改善复苏新技术，减少颗粒细胞凋亡显得尤为重要。褪黑素(melatonin,MT)，化学名为N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是松果体分泌的一种重要激素，褪黑素通过抑制凋亡、减少氧化应激等机制发挥其作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法；该方法应具有可减少解冻后卵巢组织中颗粒细胞凋亡、提高卵巢组织玻璃化冷冻的效率的特点。本专利技术提供的技术方案是：一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法；依照以下步骤进行：1)卵巢组织冷冻先在基础液、平衡液、冷冻液中分别加入褪黑素(melatonin,MT)，使褪黑素浓度达到0.01mM；接着将取自人体的卵巢组织依次经基础液、平衡液、冷冻液中分别进行浸没处理5-20分钟(优选15分钟)后，再分别装入冷冻管内密封直接投入液氮中冷冻保存；所述基础液中含有20份牛血清与80份磷酸盐缓冲液；所述平衡液中含有7.5份乙二醇、7.5份二甲基亚砜以及85份基础液；所述冷冻液中含有15份乙二醇、15份二甲基亚砜、70份基础液以及0.5mol/L的蔗糖。2)卵巢组织的解冻先在1mol/L的蔗糖液、0.5mol/L的蔗糖液以及0.25mol/L的蔗糖液中分别加入褪黑素，获得褪黑素浓度为0.01mM的三种复苏液，而后进行37℃预热；接着取出冷冻1周后的冷冻管，打开冷冻管帽将卵巢组织依次迅速浸入经37℃预热后的三种复苏液中逐步稀释去除冷冻保护剂；解冻浸入次序依次为含1mol/L蔗糖液的复苏液、含0.5mol/L蔗糖液的复苏液以及含0.25mol/L蔗糖液的复苏液；每次解冻平衡时间为5min；最后将卵巢组织用基础液冲洗2遍，每次5min。所述基础液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；每100ml基础液中包含20ml胎牛血清及80ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)，经0.22μm滤器过滤混匀后4℃备用。所述平衡液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；每100ml平衡液中包含7.5ml分析纯乙二醇、7.5ml二甲基亚砜及85ml基础液，混匀后4℃保存备用。所述冷冻液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；每100ml基础液中包含15ml分析纯乙二醇、15ml二甲基亚砜、70ml基础液及0.5mol/L的蔗糖，混匀后4℃保存备用。所述1mol/L蔗糖液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；先电子天平称取蔗糖3.42克，置于15ml无菌离心管中，向离心管加入基础液5ml，颠倒离心管使蔗糖充分溶解，再加入基础液至10ml，0.22μm滤器过滤后备用；4℃保存，使用期限为1周。所述0.5mol/L蔗糖液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；先电子天平称取蔗糖1.71克，置于15ml无菌离心管中，向离心管加入基础液5ml，颠倒离心管使蔗糖充分溶解，再加入基础液至10ml，0.22μm滤器过滤后备用；4℃保存，使用期限为1周。所述0.25mol/L蔗糖液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；先电子天平称取蔗糖0.855克，置于15ml无菌离心管中，向离心管加入基础液5ml，颠倒离心管使蔗糖充分溶解，再加入基础液至10ml，0.22μm滤器过滤后备用；4℃保存，使用期限为1周。本专利技术的独特点(与现有相同或相近技术比较)：1.在玻璃化冷冻液(基础液、平衡液、冷冻液)及复苏液(1mol/L蔗糖、0.5mol/L蔗糖、0.25mol/L蔗糖)均添加0.01mM褪黑素，提升了冷冻卵巢组织抗凋亡的能力。2.本专利技术的亮点是在玻璃化冷冻液及复苏液中均添加0.01mM褪黑素。3.通过本专利技术的应用，玻璃化冷冻解冻后小鼠卵巢组织中颗粒细胞凋亡减少，说明褪黑素具有一定的抗凋亡作用，从而提高卵巢组织冷冻的效率。本专利技术的有益效果是1、本专利技术通过冷冻前在玻璃化冷冻液中添加0.01mM褪黑素，以及复苏时在复苏液中添加0.01mM褪黑素可以减少解冻后卵巢组织中颗粒细胞凋亡，从而提高卵巢组织玻璃化冷冻的效率。2、本专利技术方法简单，耗时短，且能有效减少卵巢组织玻璃化冷冻后颗粒细胞的凋亡，提高卵巢组织玻璃化冷冻的效率。附图说明图1是褪黑素作用浓度梯度以及时间梯度示意图；其中：A图是在CVC434细胞培养液中加入不同浓度的褪黑素作用24小时后行蛋白印迹检测凋亡相关因子Bcl-2及Caspase-8的表达图；B图是在CVC434细胞培养液中加入0.01mM的褪黑素，作用不同时间，通过蛋白印迹检测凋亡相关因子Bcl-2和Caspase-8的表达图；C图是CVC434细胞经凋亡诱导剂CCCP75uM处理40分钟后添加褪黑素0.01mM处理24小时，通过蛋白印迹检测凋亡相关因子Caspase-3、cleaved-parp和Bcl-2和的表达图。图2为流式细胞术验证MT的抗凋亡作用示意图；其中：A图为CVC434细胞培养液空白对照组(A组)示意图；B图为CVC434细胞培养液经凋亡诱导剂CCCP75uM处理40分钟(B组)示意图；C图为0.01mMMT处理24小时后CCCP75uM处理40分钟(C组)示意图；D图为对A、B、C三组晚期凋亡细胞百分率(每组左边格子填充柱子)、以及总凋亡细胞百分率(每组右边斜条纹填充柱子)统计分析；P<0.001。格子柱子代表晚期凋亡细胞百分率，斜条纹柱子代表总凋亡细胞百分率。表明CVC434细胞培养液进行0.01mM的MT处理后抗凋亡能力明显增强。图3为组织学验证MT的抗凋亡作用示意图，表明褪黑素作用可降低冷冻卵巢组织凋亡水平；其中：A图为ICR小鼠卵巢新鲜组照片(HE200X)；B图为ICR小鼠卵巢玻璃化冷冻组复苏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法；依照以下步骤进行：/n1)卵巢组织冷冻/n先在基础液、平衡液、冷冻液中分别加入褪黑素(melatonin,MT)，使褪黑素浓度达到0.01mM；接着将取自人体的卵巢组织依次经基础液、平衡液、冷冻液中分别进行浸没处理5-20分钟后，再分别装入冷冻管内密封直接投入液氮中冷冻保存；/n所述基础液中含有20份牛血清与80份磷酸盐缓冲液；/n所述平衡液中含有7.5份乙二醇、7.5份二甲基亚砜以及85份基础液；/n所述冷冻液中含有15份乙二醇、15份二甲基亚砜、70份基础液以及0.5mol/l的蔗糖；/n2)卵巢组织的解冻/n先在1mol/L的蔗糖液、0.5mol/L的蔗糖液以及0.25mol/L的蔗糖液中分别加入褪黑素，获得褪黑素浓度为0.01mM的三种复苏液，而后进行37℃预热；/n接着取出冷冻1周后的冷冻管，打开冷冻管帽将卵巢组织依次迅速浸入经37℃预热后的三种复苏液中逐步稀释去除冷冻保护剂；解冻浸入次序依次为含1mol/L蔗糖液的复苏液、含0.5mol/L蔗糖液的复苏液以及含0.25mol/L蔗糖液的复苏液；每次解冻平衡时间为5min；最后将卵巢组织用基础液冲洗2遍，每次5min。/n...

【技术特征摘要】
1.一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法；依照以下步骤进行：
1)卵巢组织冷冻
先在基础液、平衡液、冷冻液中分别加入褪黑素(melatonin,MT)，使褪黑素浓度达到0.01mM；接着将取自人体的卵巢组织依次经基础液、平衡液、冷冻液中分别进行浸没处理5-20分钟后，再分别装入冷冻管内密封直接投入液氮中冷冻保存；
所述基础液中含有20份牛血清与80份磷酸盐缓冲液；
所述平衡液中含有7.5份乙二醇、7.5份二甲基亚砜以及85份基础液；
所述冷冻液中含有15份乙二醇、15份二甲基亚砜、70份基础液以及0.5mol/l的蔗糖；
2)卵巢组织的解冻
先在1mol/L的蔗糖液、0.5mol/L的蔗糖液以及0.25mol/L的蔗糖液中分别加入褪黑素，获得褪黑素浓度为0.01mM的三种复苏液，而后进行37℃预热；
接着取出冷冻1周后的冷冻管，打开冷冻管帽将卵巢组织依次迅速浸入经37℃预热后的三种复苏液中逐步稀释去除冷冻保护剂；解冻浸入次序依次为含1mol/L蔗糖液的复苏液、含0.5mol/L蔗糖液的复苏液以及含0.25mol/L蔗糖液的复苏液；每次解冻平衡时间为5min；最后将卵巢组织用基础液冲洗2遍，每次5min。


2.根据权利要求1所述的提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法，其特征在于：所述基础液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；每100ml基础液中包含20ml胎牛血清及80ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)，经0.22μm滤器过滤混匀后4℃备用。


3.根据权利要求2所述的提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张松英，施丽冰，危先江，竺海燕，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33