一种保护液及其制备方法和应用技术

本申请公开了一种保护液及其制备方法和应用。本申请的保护液包括冻存剂和完全培养基；冻存剂由渗透性保护剂和非渗透性保护剂组成，非渗透性保护剂中含有β‑1,3葡聚糖；完全培养基由无血清基础培养基、血清替代物和左旋谷氨酰胺组成；保护液中不含胎牛血清、自体脐血血清和人血白蛋白。本申请保护液能为组织细胞提供良好冻存环境，β‑1,3葡聚糖可增加保护液稳定性，提高冻存组织保护效果和复苏后细胞活率；完全培养基，为脐带组织和细胞提供营养，与干细胞复苏与培养的培养基保持一致，增加了保护液制备和应用的便利性。本申请保护液具有使用方便、冻存制剂制备周期短、成本低、临床应用安全可靠等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种保护液及其制备方法和应用
本申请涉及组织细胞冻存
，特别是涉及一种用于组织细胞冻存的保护液及其制备方法和应用。
技术介绍
脐带是连接胎盘与胎儿的管状结构，外层为羊膜，内有2条脐动脉和1条脐静脉，在脐带内壁与脐带血管之间的胶状结缔组织为华通氏胶，即人脐带华通氏胶组织。通过培养，每1g脐带华通氏胶组织可以得到约106个原代间充质干细胞。脐带间充质干细胞属于多能干细胞，具有自我更新和多向分化的能力，能够分化为多种细胞和组织，免疫原性低，可以分泌多种细胞因子，调节免疫系统，促进组织和器官损伤的修复，可以用于治疗骨关节炎，移植物抗宿主病、糖尿病等多种疾病；因此，脐带华通氏胶组织及脐带间充质干细胞具有广泛的临床应用前景。并且，与其他组织来源相比，选择新生儿脐带作为间充质干细胞来源有很多优点，例如含量丰富，采集过程简单，对捐赠者无损伤，而且不涉及伦理问题。目前干细胞移植和治疗普遍使用预先储存的干细胞，即先对华通氏胶组织进行分离和原代培养，获得脐带间充质干细胞，再将其冻存以备后续使用。这种冻存方式，制备周期长、成本高，细胞培养与扩增过程会增加细胞的代次，并且冻存过程对细胞活性也会产生一定的不利影响，降低复苏后细胞培养和临床应用的稳定性。因此，也有直接对华通氏胶组织进行冻存的研究。无论是华通氏胶组织直接冻存，还是细胞分离后冻存，冻存保护液的成分都会直接影响冻存效果，影响后续使用。现有的华通氏胶组织冻存保护液，主要包括含有胎牛血清或自体脐血血清的保护液以及含有人血白蛋白的保护液。对于含有胎牛血清或自体脐血血清的保护液，其中，胎牛血清为异种动物源，可能含有未经检测的蛋白或病毒等危险成分，会大大增加干细胞临床应用的风险；而自体脐血血清来源不能保证，采集量有限，并且血清质量会受当前身体条件等多种因素共同影响，不能确保质量稳定可靠。此外，胎牛血清与自体脐血血清都存在批次差异，无法保证质量的均一性。因此，无法保障保护液的质量和稳定性。对于含有人血白蛋白的保护液，其中，人血白蛋白为人源血液制品，为同种异体成分；当使用含有人血白蛋白的冻存保护液储存组织和细胞时，会存在传播某些病原体的潜在风险。并且，人血白蛋白同样存在批次差异，无法保证质量的均一性。而且人血白蛋白的成本高昂，不利于生产成本控制。总的来说，现有技术存在的冻存保护液普遍含有动物血清或人血白蛋白、冻存制剂制备周期长、制备成本高、冻存复苏过程损伤细胞活性等不利于干细胞未来临床应用的诸多问题，目前行业内对更加安全可靠和低成本的细胞与组织冻存技术具有迫切的需求。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种改进的用于组织冻存的保护液及其制备方法和应用。本申请具体采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种保护液，包括冻存剂和完全培养基；冻存剂由渗透性保护剂和非渗透性保护剂组成，并且，非渗透性保护剂中含有β-1,3葡聚糖；完全培养基由无血清基础培养基、血清替代物和左旋谷氨酰胺组成；并且，保护液中不含胎牛血清、自体脐血血清和人血白蛋白。需要说明的是，本申请的保护液，其中渗透性保护剂是小分子物质，可以透过细胞膜渗透到组织细胞内部，例如本申请的一种实现方式中能够渗透到脐带华通氏胶组织细胞的内部，降低细胞内外的电解质浓度，保护细胞避免受到高浓度电解质的损伤，同时避免细胞过度脱水。非渗透性保护剂是大分子物质，可以与组织细胞外部溶液中的水分子结合，降低自由水的含量、使冰点降低、减少冰晶的形成与冰晶对组织细胞的物理性损伤，同时降低溶液中的电解质浓度，从而减轻组织和细胞的损伤。β-1,3葡聚糖是一种天然存在的非淀粉多糖，广泛存在于酵母、海藻、燕麦等微生物和植物的细胞壁中。β-1,3葡聚糖是由D-葡萄糖单体经过β-1,3糖苷键连接形成的一种具有不同的支链长度的多糖，这种连接方式可以形成螺旋形分子结构，使β-1,3葡聚糖容易被免疫系统所接受。β-1,3葡聚糖是一种安全的化合物，在输血过程中可代替一部分全血，作为血浆体积扩容剂，还可以用于食品、药品、护肤品、饲料等。β-1,3葡聚糖具有增强免疫系统，抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、降低胆固醇和血脂、促进伤口愈合等功能，是一种良好的生物效应调节剂。本申请创造性的在保护液中添加β-1,3葡聚糖，由于β-1,3葡聚糖有较高的黏性和吸水性，可以增加冻存保护液的稳定性，提高对冻存组织的保护效果和复苏后细胞的活率。并且，本申请的保护液中还含有完全培养基，可以为组织和细胞提供营养，与干细胞复苏与培养所使用的培养基保持一致，增加了冻存保护液制备和应用的便利性。还需要说明的是，本申请的保护液不含胎牛血清，避免了引入异种动物来源成份的风险，提高了冻存制剂与未来间充质干细胞临床应用的安全性；不含有人血白蛋白，避免了传播某些病原体的潜在风险，同时降低了生产成本；不含自体脐血血清等具有批次差异的成分，能够有效保障保护液的质量均一性。优选的，本申请的保护液中，β-1,3葡聚糖在保护液中的浓度为0.1mg/mL-9mg/mL。需要说明的是，本申请的关键之一是在保护液中使用β-1,3葡聚糖，其具有较高的黏性和吸水性，可以增加冻存保护液的稳定性，提高对冻存组织的保护效果和复苏后细胞的活率；可以理解，只要在保护液中添加β-1,3葡聚糖就可以在不同程度上发挥其效果，本申请限定的浓度只是本申请的一种实现方式中具体采用的符合试验设计和要求的浓度，根据不同的使用需求或者试验需求，可以在该浓度范围内或范围外进行调整。原则上，低于本申请限定的浓度，其对保护液的稳定性效果相应降低；而β-1,3葡聚糖浓度太高一方面其效果增加不显著，另一方面会影响保护液中其它组分的含量，反而不利于冻存，并且β-1,3葡聚糖浓度太高也会增加保护液成本。优选的，β-1,3葡聚糖在保护液中的浓度为0.45mg/mL、2.25mg/mL或者9mg/mL。优选的，本申请的保护液中，无血清基础培养基、血清替代物与左旋谷氨酰胺的体积比为97:2:1；或者，无血清基础培养基、血清替代物与左旋谷氨酰胺的体积比为95:4:1。需要说明的是，本申请的保护液中，无血清基础培养基、血清替代物与左旋谷氨酰胺组成完全培养基。完全培养基的作用一方面是为组织和细胞提供营养，另一方面是与干细胞复苏与培养所使用的培养基保持一致。因此，可以根据需要，在保障营养供给的情况下，调整各组分配比，使其与干细胞复苏与培养的培养基保持一致。无血清基础培养基、血清替代物与左旋谷氨酰胺的体积比为97:2:1或95:4:1，只是本申请的一种实现方式中具体采用的配比，不排除还可以采用其它配比方案。优选的，本申请的保护液中，冻存剂中非渗透性保护剂与渗透性保护剂的体积比为1:1，完全培养基与冻存剂的体积比为9:1；或者，冻存剂中非渗透性保护剂与渗透性保护剂的体积比为3:1，完全培养基与冻存剂的体积比为4:1；或者，冻存剂中非渗透性保护剂与渗透性保护剂的体积比为4:1，完全培养基与冻存剂的体积比为3:1；或者，冻存剂中非渗透性保护剂与渗透性保护剂的体积比为9:1，完全培养基与冻存剂的体积比为1:1。...

【技术保护点】
1.一种保护液，其特征在于：所述保护液包括冻存剂和完全培养基；/n所述冻存剂由渗透性保护剂和非渗透性保护剂组成，并且，非渗透性保护剂中含有β-1,3葡聚糖；/n所述完全培养基由无血清基础培养基、血清替代物和左旋谷氨酰胺组成；/n并且，所述保护液中不含胎牛血清、自体脐血血清和人血白蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种保护液，其特征在于：所述保护液包括冻存剂和完全培养基；
所述冻存剂由渗透性保护剂和非渗透性保护剂组成，并且，非渗透性保护剂中含有β-1,3葡聚糖；
所述完全培养基由无血清基础培养基、血清替代物和左旋谷氨酰胺组成；
并且，所述保护液中不含胎牛血清、自体脐血血清和人血白蛋白。


2.根据权利要求1所述的保护液，其特征在于：所述β-1,3葡聚糖在保护液中的浓度为0.1mg/mL-9mg/mL；
优选的，所述β-1,3葡聚糖在保护液中的浓度为0.45mg/mL、2.25mg/mL或者9mg/mL。


3.根据权利要求1所述的保护液，其特征在于：所述无血清基础培养基、血清替代物与左旋谷氨酰胺的体积比为97:2:1；
或者，所述无血清基础培养基、血清替代物与左旋谷氨酰胺的体积比为95:4:1。


4.根据权利要求1所述的保护液，其特征在于：所述冻存剂中非渗透性保护剂与渗透性保护剂的体积比为1:1，完全培养基与冻存剂的体积比为9:1；
或者，所述冻存剂中非渗透性保护剂与渗透性保护剂的体积比为3:1，完全培养基与冻存剂的体积比为4:1；
或者，所述冻存剂中非渗透性保护剂与渗透性保护剂的体积比为4:1，完全培养基与冻存剂的体积比为3:1；
或者，所述冻存剂中非渗透性保护剂与渗透性保护剂的体积比为9:1，完全培养基与冻存剂的体积比为1:1。


5.根据权利要求1所述的保护液，其特征在于：所述保护液由5-20体积的渗透性保护剂、2-50体积的非渗透性保护剂、0.2-1体积的左旋谷氨酰胺、1-10体积的血清替代物，以及45-90体积的无血清基础培养基组成；
优选的，所述保护液由5体积的渗透性保护剂、45体积的非渗透性保护剂、0.5体积的左旋谷氨酰胺、1体积的血清替代物，以及48.5体积的无血清基础培养基组成。


6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：王魁星，李国喜，陈选年，常崇斐，
申请(专利权)人：深圳华大基因细胞科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广东;44