快速检测甲霜灵残留的胶体金试纸制造技术

一种快速检测甲霜灵残留的胶体金试纸，由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、甲霜灵单克隆抗体金标垫、样品吸液层组成。底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有甲霜灵－ＢＳＡ联结物试验线和一条多克隆抗体控制线，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和甲霜灵单克隆抗体金标垫相互交叠连接，在甲霜灵单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层，通过胶体金免疫竞争方法制成试纸，利用免疫胶体金法来检测果蔬中的甲霜灵残留量是否超标。该方法具有快速、灵敏、操作简便、成本低、无需专业人员检测，真正达到复杂原理与简易操作的有机统一，同时具有保存方便，有效期长的特点。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于果蔬及原粮类食品中甲霜灵残留检测试纸及其检测方法，属胶体金免疫检测领域。
技术介绍
由于蔬菜生长期短且病虫害较为严重，因而，在蔬菜种植过程中常常需要连续多次施药。而不少蔬菜需要多次采收，采收与施药的时间间隔短，造成采收时蔬菜中的农药残留量往往较高，很容易超过国家规定的标准。而蔬菜中农药残留量超标会严重影响人类健康水平，已成为不容忽视的食品污染源。政府和各职能部门对食品的农药残留问题十分关注。但由于农药的毒性和害虫的抗药性形成一个恶性循环，因此全面彻底禁止高剧毒农药的使用将有一个较长的过程，即使是全面使用中、低毒农药，农药恶性中毒事件仍然发生。因此对分析检测的对象、种类、数量、范围、指标等诸多方面都提出了新的要求和更高标准。甲霜灵(metalaxyl，D，L-N-(2，6-二甲基苯基)-N-(2’-甲氧基乙酰)丙氨酸甲酯)，属苯基酰胺类，是一种作为保护和治疗作用的内吸性杀菌剂，可由种子、根、茎、叶吸收并传导到植物内部，适用于由空气和土壤带菌病害的预防和治疗，主要用于防治各种气候条件下由霜霉目真菌引起的病害。如马铃薯晚疫病、葡萄霜霉病、烟草霜霉病、啤酒花霜霉病和莴苣霜霉病。虽然甲霜灵对人畜的毒性不高，但是属于内吸性杀菌，在食品和蔬菜中的残留量季节性超标情况较多，中毒事件常有发生。鉴于上述情况，甲霜灵已被列为农药残留的重要检测对象。目前，检测农药残留的分析方法主要是依靠、气相色谱法(GC)或气相色谱与质谱(MS)联用法(GC/MS)。“酶抑制率法+分光光度法”已被列为国家推荐标准(GB/T 5009.199-2003)。该法快速、灵敏、操作简便且成本低廉，可实现快速初筛，但受检测范围和精度的限制。而气相色谱法(GC)可实现精度的定量分析但速度较慢，检测成本较高。总之，这些方法普遍存在着样品前处理过程复杂，灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响很大，耗时，检测设备昂贵，并要求有专业的技术人员及较长的分析周期。因此，利用竞争法原理，在传统免疫检测法的基础上引入了胶体金快速检测技术，研制出甲霜灵胶体金竞争法检测试纸。该方法具有快速、灵敏、操作简便、成本低、无需专业人员检测，真正达到复杂原理与简易操作的有机统一，同时具有保存方便，有效期长的特点。
技术实现思路
本专利技术针对上述存在的一些问题，提供了一种适用于检测甲霜灵是否超标的胶体金测定试纸。为解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的在甲霜灵残留检测试纸底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线和一条羊抗鼠多克隆抗体控制线，在底板一端端头为吸水层，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水层和甲霜灵单克隆抗体金标垫相互交叠连接(交叠连接部分在1-2毫米范围)，在甲霜灵单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层。关于底板、硝酸纤维素膜、吸水纸、胶体金标垫的组合方法已是公知技术。万华普曼生物工程有限公司于1998年获得竞争法检测吗啡试纸的国药字批准文号国药准字S19990038号，并将产品投放市场。甲霜灵残留检测试纸的控制线是由羊抗鼠多克隆抗体包被而成，试验线是由甲霜灵-BSA包被。把检测甲霜灵残留的胶体金试纸的样品吸液层端放入果蔬汁中，由于毛细管作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，当移动至甲霜灵单克隆抗体金标垫时，样品中的甲霜灵与甲霜灵单克隆抗体金标探针发生特异结合，当移动至固定有甲霜灵-BSA联结物试验线时，由于甲霜灵单克隆抗体金标垫中的抗体与样品中甲霜灵优先结合成复合物而失去其与甲霜灵-BSA结合，因此其胶体金不能滞留于试验线上，试验线处没有红色线显示，即只有一条红色控制线为阳性；相反如果样品中没有甲霜灵，甲霜灵单克隆抗体金标垫中的抗体移动到试验线上，甲霜灵单克隆抗体就会与甲霜灵-BSA联结物发生特异结合，使胶体金滞留于试验线上，即二条红色线为阴性，这就是免疫竞争法原理。试验线的颜色深浅与样品中甲霜灵含量高低成反比。从阳性过渡到阴性，由于所测甲霜灵含量不同，试验线的颜色也不同，形成一个红色颜色梯度差，以这种原理检测出OD值，从而推断出试验线所反应实际甲霜灵的量。试验线的最低检出量可达甲霜灵含量为50ng/ml。试验线的检测值设定为国家颁布的果蔬农药残留检测标准甲霜灵含量为0.5mg/kg或小粒水果农药残留检测标准甲霜灵含量为1mg/kg或原粮农药残留检测标准甲霜灵含量为0.05mg/kg。用竞争法制成试纸其检测甲霜灵设定检出量以上，观察窗处出现一条红线为阳性；设定检出量以下出现双红线为阴性；设定检出量时在试验线处为一条模糊阴影线为界限值，从而得出判断。当移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，无论样品中有无甲霜灵，标记的金标探针都会与已设定好的羊抗鼠多克隆抗体结合滞留，使控制线显示红色。因此控制线无色带产生则代表操作有误，检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。由于采用上述技术方案，本专利技术所提供的一种快速检测甲霜灵残留的胶体金试纸具有这样的有益效果，即特异性强，灵敏度高，易储存，无须专门技术人员操作，而且结果易读。附图说明图1为本专利技术一种快速检测甲霜灵残留的胶体金试纸的主视结构图。图2为专利技术图一的侧视结构图。图3为检测显示阳性结果图。图4为检测显示阴性结果图。图中1、吸水板，2、硝酸纤维素膜，3、羊抗鼠多克隆抗体控制线，4、试验线，5、单克隆抗体金标垫，6、样品吸液层，7、底板，8、MAX线。具体实施例1.利用化学方法将小份子甲霜灵与大分子BSA联接合成免疫原即甲霜灵-BSA。2.甲霜灵单克隆抗体的制备(1)将制备的甲霜灵-BSA免疫BALB/c小鼠。用SP20细胞融合建立瘤株进行筛选，取瘤细胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其产生腹水。(2)提取小鼠腹水纯化筛选，获得能同时与甲霜灵分子结合的单克隆抗体用于胶体金标记。3.胶体金的制备及与甲霜灵单克隆抗体的结合(1)取双蒸水加适量的氯金酸磁力搅拌加温到90～95℃，加入适量枸橼酸三纳继续加热搅拌至沸腾5分钟，冷却后避光保存备用。(2)把甲霜灵单克隆抗体标记的胶体金液，吸附纤维材料上，干燥后备用。4.制膜机制膜利用电脑控制传动速度，保证每单位膜上包被的抗体量相等。5.试纸条组合按公知技术组合。6.使用方法把试纸的样品吸液层端放入果蔬汁中(液面不得超过MAX线图中8)，1分钟后取出试纸平放，由于毛细管和虹吸作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，5分钟时观察结果。7.结果判断检测甲霜灵浓度0.5mg/kg以上，观察窗处出现一条红线为阳性；0.5mg/kg以下出现双红线为阴性；0.5mg/kg时在试验线处为一条模糊阴影线为界限值，此界限值为国家颁布的蔬菜农药残留检测标准0.5mg/g。从而得出判断。权利要求1.一种快速检测甲霜灵残留的胶体金试纸，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纤维素膜(2)、甲霜灵单克隆抗体金标垫(5)、样品吸液层(6)组成；底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线(4)和一条多克隆抗体控制线(3)，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和甲霜灵单克隆抗体金标垫相互交叠连接，在甲霜灵单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层。2.根据权利要求1所述的一种快速检测甲霜灵残留的胶体金试纸，其特征在于控制线是由羊抗鼠多克隆抗体包被制成。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测甲霜灵残留的胶体金试纸，其特征在于是由底板（７）、吸水板（１）、硝酸纤维素膜（２）、甲霜灵单克隆抗体金标垫（５）、样品吸液层（６）组成；底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线（４）和一条多克隆抗体控制线（３），底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和甲霜灵单克隆抗体金标垫相互交叠连接，在甲霜灵单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：万积成，
申请(专利权)人：万积成，
类型：实用新型
国别省市：11[中国|北京]