一种检测移植肾功能的寡核苷酸芯片制造技术

本实用新型专利技术提供一种移植肾功能检测核苷酸芯片，由基质尼龙膜１、点样区２、固定在尼龙膜１表面矩阵分布的经修饰及杂交的寡核苷酸探针３组成，寡核苷酸探针３，采用接触式打印的方法，将由ＢＩＯ　　ＢＡＳＩＣ　　ＩＮＣ（Ｃａｎｄａ）公司合成的特异性代表一个基因的７０ｂｐ的寡核苷酸探针３点样于尼龙膜１上。本实用新型专利技术设计合理，可早期、快速、廉价、准确检测移植肾功能，可在移植肾功能检测中应用。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术属于生物医学
，具体涉及一种能检测移植肾功能的寡核苷酸芯片，能检测不同移植肾功能状态包括肾功能稳定状态，急性排斥，急性肾小管坏死等。
技术介绍
急性排斥是肾移植术后最常见的并发症，可直接导致移植肾功能丢失或影响移植肾的长期存活。目前急性排斥的诊断主要依靠肾组织活检，是一创伤性的检查，并收到取样限制。许多研究者采用各种实验方法试图寻找急性排斥的生物标志物，诊断急性排斥，但均未能广泛应用于临床。芯片技术是20世纪90年代发展起来的一项前沿的分子生物学技术，是微电子，化学，计算机科学等学科交错综合发展的新产物。依据核酸分子杂交原理检测代测样本中的核酸序列及基因表达信息。目前基因芯片技术已成为生物医学研究中的一个强有力的工具，可用于基因表达谱研究、基因功能研究、基因多态性分析、DNA测序、疾病相关基因的表达调控、临床诊断、药物筛选以及指导用药等多个方面。在肾脏移植领域，基因芯片可以对肾移植术后不同肾功能状态下外周血细胞和组织中的基因表达水平进行大规模快速检测，并通过生物信息学对这些基因特异性进行综合分析，从而进一步认识免疫应答过程。而表达谱芯片是目前肾移植临床研究中应用最广泛的是一种芯片。虽然表达谱芯片较传统方法相比较具有高度的并行性，高效性，高灵敏度，自动化和能更全面地研究某一表型或病症的有关基因。但是在临床疾病研究中广泛使用表达谱芯片检测几千个基因是不现实的，研究人员希望芯片上被研究的基因数目能够减少，因为由许多与研究对象无关的基因所提供的数据会对分析与研究对象有关的基因产生干扰，提供无用的或错误的信息。并且低丰低度表达的基因易被高丰度表达基因掩盖而检测不出。目前用于器官移植临床研究的基因芯片主要有两大类，其一是以Affymetrix公司为代表原位合成的高密度短寡核苷酸芯片，技术要求高，价格昂贵，商业合成的基因芯片，不能根据研究者需要而提供定制服务；其二是以Stanford大学研究组为代表的cDNA芯片，采用PCR方法合成后点样，其制备过程复杂，工作量大，而且杂交信号的特异性有待于-->进一步的提高。所以针对基因的功能分类，有针对性的选择与研究相关的某些基因，再结合微阵列技术制成的类似于功能分类基因芯片，可以大大缩短发现疾病相关标志物的时间。
技术实现思路
本技术的目的是提供一种移植肾功能检测核苷酸芯片，由基质尼龙膜、点样区、固定在尼龙膜表面矩阵分布的经修饰及杂交的寡核苷酸探针组成，寡核苷酸探针具有SEQ ID NO 1的序列。在芯片的点样区分别点上特异性寡核苷酸探针，点成96(12×8)个矩阵，每个矩阵包括15(5×3)个点，点的直径为0.6mm，点间距为1.5μm。本技术是采用接触式打印的方法，将由BIO BASIC INC(Canda)公司合成的特异性代表一个基因的70bp的寡核苷酸片断点样于尼龙膜上，具体通过以下步骤实现：(1)根据已发表的参考文献及移植免疫学知识，筛选出免疫相关性基因449条，合成70bp长寡核苷酸序列，由芯片制备机器人的直径为0.6mm的96针点制于尼龙膜(8×12cm)上，点之间的间距为1.5mm；(2)寡核苷酸探针液体浓度稀释，稀释成15umol/L的终浓度；(3)芯片杂交前经Ultraviolet crosslinker交联处理(60mJ/cm2)，使寡核苷酸固定在尼龙膜上；(4)芯片杂交过程：RNA样本在逆转录cDNA第一链掺入同位素33P，逆转录同位素标记体系，杂交液(1％BSA，1mmol/L EDTA(PH 8.0)，0.5mol/LNa2HPO4(PH7.2)缓冲液，7％SDS(十二烷基硫酸钠)，在杂交炉中50℃预杂交2小时(hr)，然后将已变性好的cDNA样品加入杂交管中，50℃杂交过夜，然后用洗膜液(2×SSC(氯化钠-柠檬酸盐缓冲液)，0.1％SDS)50℃洗两次，凉干，(5)数据提取与分析：尼龙膜晾干后用保鲜膜包好，用磷屏(Kodak)压膜放射自显影72hr，扫描仪Typhoon 9200扫描磷屏，使放射性信号转换为可视化图像。本技术的有益效果是：(1)本技术方法设计合理，开发了一种特异性针对肾移植患者的基因芯片；(2)早期、快速、廉价、准确检测移植肾功能；(3)可以区分不同病因导致的移植肾功能障碍包括区分急性排斥和急性肾小管坏死。(4)选择用70bp寡核苷酸的优势在于：70bp长度的核苷酸既能保证杂交-->信号的灵敏度和特异度，并且价格低廉；本技术选择了449个免疫相关的基因，基因的选择基于已有的科学理论基础和推测，特异性的针对肾移植患者，减少了无关基因对有意义基因数据分析产生干扰，提高了杂交结果的准确性。这样既达到了高通量表达谱芯片的同样目的，又可以节省大量的时间和金钱，达到事半功倍的效果。附图说明图1为本技术寡核苷酸芯片的结构示意图。图2为本技术每个基因点样示意图。具体实施方式实施例一本技术寡核苷酸芯片的制备和杂交1，芯片制备参见图1，寡核苷酸芯片由基质尼龙膜1、点样区2、固定在尼龙膜表面矩阵分布的经修饰及杂交的寡核苷酸探针3组成，寡核苷酸探针3具有SEQ IDNO 1的序列。在芯片的点样区2分别点上特异性寡核苷酸探针3，点成96(12×8)个矩阵，每个矩阵包括15(5×3)个点，点的直径为0.6mm，点间距为1.5μm。根据已有相关知识筛选出免疫相关性基因449个，利用Operon公司提供的70bp长寡核苷酸序列，交BIO BASIC INC(Canda)公司合成，参见SEQ ID NO 1的序列。1OD合成的寡核苷酸溶于100ul双蒸水(ddH2O)，浓度为15uM，吸40ul入384孔板，由芯片制备机器人(Genomic SolutionTM)的直径为0.6mm96针点制于尼龙膜(8×12cm)(ImmobilonTM-Ny+transfermembrane，Millipore CO.)上，点之间的间距为1.5mm。每个基因有平行的三个重复点(参见图2)，每个点重复点两次。制备完成的芯片于-20℃保存备用。2，杂交和数据分析芯片杂交过程：RNA样本在逆转录cDNA第一链掺入同位素33P，逆转录同位素标记体系，杂交液(1％BSA，1mmol/L EDTA(PH 8.0)，0.5mol/L Na2HPO4(PH7.2)缓冲液，7％SDS。)，在杂交炉中50℃预杂交2hr，然后将已变性好的cDNA样品加入杂交管中，50℃杂交过夜。然后用洗膜液(2×SSC，0.1％SDS)50℃洗两次，凉干后用磷屏(Kodak)压膜放射自显影72hr，扫描仪Typhoon9200扫描磷屏，使放射性信号转换为可视化图像。实施例二本技术制备的寡核苷酸芯片的用途1：芯片的重复性和准确性预实验10个探针，每个探针独立两次杂交的结果，R2值为0.88-0.95，根-->据芯片间数据的相关系数R2＞0.81即被公认为实验具良好重复性这一标准，本文所获的杂交数据具良好重复性，能够用于后续分析。急性排斥组与肾功能稳定组比较筛选出的最显著差异表达的10个基因，实时定量PCR验证的结果与芯片的检测结果相一致，均表现为在急性排斥组中高表达，验证了芯片杂交结果的准确性。2：临床标本的检测共完成了62例移植受者的PB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测移植肾功能的核苷酸芯片，其特征在于：由基质尼龙膜（１）、点样区（２）、固定在基质尼龙膜（１）表面矩阵分布的经修饰及杂交的寡核苷酸探针（３）组成，寡核苷酸探针（３）具有ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ　　１的序列。

【技术特征摘要】
1. 一种检测移植肾功能的核苷酸芯片，其特征在于：由基质尼龙膜(1)、点样区(2)、固定在基质尼龙膜(1)表面矩阵分布的经修饰及杂交的寡核苷酸探针(3)组成，寡核苷酸探针(3)具有SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈江华，何强，茅幼英，杨浩，董海涛，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：实用新型
国别省市：86[中国|杭州]