本发明专利技术涉及使用CRISPR/Cpf1系统的基因组编辑组合物及其用途，并且更具体地，涉及基因组编辑组合物，其包含：包含能够与靶核苷酸序列杂交的指导序列和连接至所述指导序列的3’末端的尿苷重复序列的CRISPR RNA(crRNA)或其编码DNA；以及Cpf1蛋白或其编码DNA，使用所述组合物的基因组编辑方法、转基因实体的构建方法以及转基因实体。使用CRIPSPR/Cpf1系统，本发明专利技术可以在基因组编辑中提高插失效率并降低脱靶活性，并且因此可以容易地构建具有插入其中(敲入)或从其中缺失(敲除)的期望基因的转化细胞或者转基因动物或植物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用CRISPR/Cpf1系统的基因组编辑组合物及其用途
本专利技术涉及用于使用CRISPR/Cpf1系统进行基因组编辑的组合物及其用途，并且更具体地，涉及用于基因组编辑的组合物，其包含：包含与靶核苷酸序列互补的指导序列和连接至所述指导序列的3’末端的尿苷(U)重复序列的CRISPRRNA(crRNA)，或编码所述crRNA的DNA；以及Cpf1蛋白或编码所述Cpf1蛋白的DNA，使用所述组合物的基因组编辑方法、遗传修饰生物的构建方法以及遗传修饰生物。
技术介绍
基因组编辑是指通过自由地校正生物的遗传信息来表现出期望遗传性状的方法，并且通过开发CRISPR相关蛋白(CRISPR/Cas)系统已经在用于从研究基因功能到治疗疾病的多个领域中的同时取得了显著的发展。成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)是存在于细菌和古细菌的基因组中的含有多个短的直接重复序列的基因座，其基因序列已被揭示，并且作为获得性原核免疫系统发挥作用以赋予对外源遗传元件(例如病毒和噬菌体)的抗性。被称为前间隔序列的外源DNA的短基序在CRISPR重复序列之间被整合到基因组中，并用于记住过去对外部因素的暴露。这样整合的基序的间隔序列用作产生指导RNA的模板，并用于切割外部侵入的遗传物质。基于CRISPR的基因编辑技术的核心在于在生物中使用RNA作为介质识别特定碱基序列，通过效应蛋白(例如Cas9)在相应基因位点诱导双链断裂(DSB)，并且然后修复DSB的过程。在真核细胞中恢复由CRISPR/Cas系统产生的DSB的过程中，存在非同源末端连接(NHEJ)，其中在截短的碱基序列中发生随机插入和缺失(indel)，以及同源性指导的修复(HDR)，其使用具有与被切割DNA的附近区域相同的碱基序列的DNA链为模板来修复切割位点。每种基因修复方法都能够进行敲除，其诱导由基因碱基序列的插失引起的特定基因的移码，以及敲入，其诱导期望基因中特定碱基序列的预期插入或替换。因此，需要提高DSB频率和准确性以提高精确位置的敲除或敲入效率，并且为此目的，一直进行着旨在寻找现有CRISPR/Cas系统或新CRISPR/Cas系统的修改方法的研究。最近，像Cas9一样，在多种类型的细菌中也发现了Cpf1(来自普雷沃菌(Prevotella)和弗朗西丝菌1(Francisella1)的V型Cas系统，称为CRISPR)。Cpf1属于2类，其与Cas9一样，具有一个蛋白质作为效应蛋白，并且在crRNA(CRISPRRNA)的指导下，该效应蛋白通过识别特定的前间隔序列相邻基序(PAM)序列在DNA中引起DSB。但是，区别在于Cas9需要crRNA和反式激活crRNA(tracrRNA)用于特异性碱基序列识别和切割，而Cpf1仅需要crRNA。此外，在其中效应蛋白和crRNA复合物识别特定DNA碱基序列的PAM序列中，不同之处在于Cas9需要富含G的序列，而Cpf1识别富含T的序列。即使是在这种情况下产生的DSB的形式，Cas9在靠近PAM的位点切割成平末端，而Cpf1在距离PAM18-23个核苷酸(nt)处切割成交错末端。另外，Cpf1的基因尺寸小于Cas9，因此预期对于临床目的更加有用。Cpf1的上述特征可在基因治疗中发挥优势。尤其是，与Cas9相比，需要尺寸相对小的蛋白质和crRNA的Cpf1特征可具有极大的优势，因为当使用病毒(例如腺相关病毒(AAV))将用于基因编辑的遗传物质递送到人体中时，可以递送的遗传物质的尺寸具有限制。另外，即使在基因治疗的稳定性方面，与Cas9相比Cpf1的脱靶结果低的事实也是重要的优势。但是，由于迄今已发现，相对于Cas9，Cpf1的插失效率相对较低或取决于待靶向的基因存在大偏差，所以难以代替Cas9。因此，为了在使Cpf1的优势最大化的情况下代替或超越Cas9，必须开发提高Cpf1的插失效率的方法。可以通过操纵CRISPR/Cas系统中的效应核酸内切酶或指导RNA来提高靶基因的插失效率或准确性，并且在Cas9的情况下，这样的研究已经积极开展，而对Cpf1系统的研究不足。[专利技术详述][技术问题]因此，作为对开发能够克服CRISPR/Cas9系统的缺点的CRISPR/Cpf1系统的深入研究的结果，本专利技术人发现，与相关领域中具有crRNA的Cpf1系统和Cas9系统相比，通过在用于CRISPR/Cpf1系统的crRNA的3’-末端序列添加尿苷重复序列，改善了插失效率，从而完成了本专利技术。本专利技术的一个目的是提供CRISPR/Cpf1系统中的多核苷酸，其由连接至与靶核苷酸序列互补的指导序列的3’末端的尿苷(U)重复核苷酸序列组成。本专利技术的另一个目的是提供用于基因组编辑的组合物，其包含：包含与靶核苷酸序列互补的指导序列和连接至所述指导序列的3’末端的尿苷(U)重复序列的CRISPRRNA(crRNA)，或编码所述crRNA的DNA；以及Cpf1蛋白或编码所述Cpf1蛋白的DNA。本专利技术的又一个目的是提供用于基因组编辑的方法，所述方法包括：将用于基因组编辑的组合物引入分离的细胞或生物中。本专利技术的又一个目的是提供用于构建遗传修饰生物的方法，所述方法包括：将用于基因组编辑的组合物引入分离的细胞或生物中。本专利技术的又一个目的是提供通过所述方法构建的遗传修饰生物。技术方案本专利技术的一个方面提供了CRISPR/Cpf1系统中的多核苷酸，其由连接至与靶核苷酸序列互补的指导序列的3’末端的尿苷(U)重复核苷酸序列组成。本专利技术的另一方面提供了用于基因组编辑的组合物，其包含：包含与靶核苷酸序列互补的指导序列、连接至所述指导序列的3’末端的尿苷重复序列的CRISPRRNA(crRNA)，或编码所述crRNA的DNA；以及Cpf1蛋白或编码所述Cpf1蛋白的DNA。本专利技术的另一方面提供了用于基因组编辑的方法，所述方法包括：将用于基因组编辑的组合物引入分离的细胞或生物中。本专利技术的另一方面提供了用于构建遗传修饰生物的方法，所述方法包括：将用于基因组编辑的组合物引入分离的细胞或生物中。本专利技术的又一方面提供了通过所述方法构建的遗传修饰生物。[有益效果]本专利技术可以在使用CRIPSPR/Cpf1系统对真核细胞进行基因组编辑中提高插失效率并降低脱靶活性，并且因此可以容易地构建具有插入其中(敲入)或从其中缺失(敲除)的期望基因的遗传修饰细胞或者遗传修饰动物或植物。附图图1至14示出了体外实验的结果，其确认在3’末端具有U重复序列的crRNA(富含U的crRNA(U-richcrRNA))提高了Cpf1的dsDNA切割效率：图1示出了结果，其确认了根据crRNA的3’末端的3核苷酸序列的突变，体内AsCpf1的插失效率的差异。图2示出了结果，其确认了根据靶标(DNMT1、LGALS3BP和VEGFA)，U3末端对插失效率的影响。图3示出了结果，其确认了根据反应时间和条件，3’末端的富含U的crRNA提高了AsCpf1的dsD本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.CRISPR/Cpf1系统中的多核苷酸，其具有连接至与靶核苷酸序列互补的指导序列的3’末端的尿苷(U)重复核苷酸序列。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171121 KR 10-2017-01559271.CRISPR/Cpf1系统中的多核苷酸，其具有连接至与靶核苷酸序列互补的指导序列的3’末端的尿苷(U)重复核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述尿苷重复核苷酸序列是由(UaV)nUb表示的核苷酸序列，其中a和b是2至20的整数，n是1至5的整数，并且V是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其中(UaV)nUb是U4AU6。
4.用于基因组编辑的组合物，其包含：包含与靶核苷酸序列互补的指导序列和连接至所述指导序列的3’末端的尿苷重复序列的CRISPRRNA(crRNA)，或编码所述crRNA的DNA；以及
Cpf1蛋白或编码所述Cpf1蛋白的DNA。
5.根据权利要求4所述的用于基因组编辑的组合物，其中所述尿苷重复序列是包含2至20个尿苷的核苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的用于基因组编辑的组合物，其中所述尿苷重复序列是包含6至10个尿苷的核苷酸序列。
7.根据权利要求4所述的用于基因组编辑的组合物，其中所述尿苷重复序列是包含8个尿苷的核苷酸序列。
8.根据权利要求4所述的用于基因组编辑的组合物，其中所述尿苷重复序列是由(UaV)nUb表示的核苷酸序列，其中a和b是2至20的整数，n是1至5的整数，并且V是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)。
9.根据权利要求8所述的用于基因组编辑的组合物，其中V是A。
10.根据权利要求8所述的用于基因组编辑的组合物，其中n是1。
11.根据权利要求8所述的用于基因组编辑的组合物，其中(UaV)nUb是U4AU6。
12.根据权利要求4所述的用于基因组编辑的组合物，其中所述指导序列的长度为18至23nt。
13.根据权利要求4所述的用于基因组编辑的组合物，其中所述Cpf1蛋白来源于选自以下的一种或更多种微生物：念珠菌(...
【专利技术属性】
技术研发人员：金龙三，高正宪，李姃美，文秀彬，
申请(专利权)人：韩国生命工学研究院，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
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