本发明专利技术属于生物医药领域，涉及血清外泌体微小RNAs的应用和肝癌检测试剂盒。所述试剂盒包括检测物，所述检测物包括：与血清外泌体微小RNA hsa‑miR‑203b‑5p特异性结合的检测物；与血清外泌体微小RNA hsa‑miR‑219a‑2‑3p特异性结合的检测物；与血清外泌体微小RNA hsa‑miR‑4661‑5p特异性结合的检测物。本发明专利技术通过抽取人的血液并对其中的血清外泌体hsa‑miR‑203b‑5p、hsa‑miR‑219a‑2‑3p和hsa‑miR‑4661‑5p进行测量就可以实现肝癌的无创、非侵袭性筛查或者诊断，操作简单方便，具有较高特异性和敏感性。
【技术实现步骤摘要】
血清外泌体微小RNAs的应用和肝癌检测试剂盒
本专利技术属于生物医药领域，更具体地，涉及血清外泌体微小RNAs作为肝癌生物标志物在制备肝癌检测试剂、肝癌检测试剂盒或者肝癌检测装置中的应用，以及一种基于血清外泌体微小RNAs的肝癌检测试剂盒。
技术介绍
原发性肝癌是世界范围内常见的高发病率、高致死率的恶性肿瘤之一，其中肝细胞性肝癌(简称肝癌，HepatocellularCarcinoma，HCC)占原发性肝癌的85％～90％以上。根据美国癌症协会(ACS)2018年针对185个国家的36种癌症统计，肝癌的新增病例数为84.1万，位居全球第7位，死亡人数为78.2万，位居全球第3位，其中，中国肝癌的新发病例及死亡病例均约占全球病例的一半，并且在全国新增癌症病例中排名第4位，死亡病例中排名第2位。由于缺乏高效、灵敏和特异性强的肝癌早期检测方法或技术，导致60％～70％的肝癌患者诊断时已处于中晚期，从而错失根治性切除机会。因此，肝癌的早期检测、早期诊断和早期治疗是提高肝癌患者生存率、降低肝癌死亡率最有效的途径之一。目前，临床上应用比较成熟的肝癌早期检测手段主要有依赖于影像学的检测手段和肿瘤生物标志物的检测手段等。在影像学检测方面，虽然许多医院和体检机构等已经拥有较为精密的仪器设备，例如电脑断层扫描，磁共振成像或者血管摄影等，但是影像学检测一般价格比较昂贵并且具有放射性或者侵袭性等，从而难以实现全覆盖式普及。在肿瘤生物标志物方面，主要有甲胎蛋白(AFP)、C反应性蛋白(CRP)和去羧凝血酶原(DCP)等，该类检测手段虽然比较有效，具有无创、非侵袭性，但是，它们的检测灵敏度和特异性比较差，其中，约有35％～50％肝癌患者的AFP水平低于警戒值(20ng/mL)，而且，AFP在早期肝癌筛查中的检出率仅为22％。因此，探究新型、高灵敏度、高特异性，并且价格低廉又易于检测的肝癌早期诊断标志物具有重要的临床意义。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一类内源性、非编码、具有调控功能的单链小RNAs，长度约为18～25个核苷酸，miRNAs在肿瘤的发生与调控方面发挥着重要的作用。近年来，大量的研究发现，在人体血液、唾液和尿液等多种体液中能够检测到大量外泌体包裹的miRNAs，该类miRNAs具有组织、细胞特异性，并且与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等密切相关。因此，外泌体miRNAs可以作为潜在的肿瘤生物标志物用于肿瘤的早期检测或诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供新的可以作为潜在肿瘤生物标志物的外泌体miRNAs。本专利技术通过实验研究发现，与健康人相比，肝癌患者血清外泌体hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p均存在显著性高表达(P<0.05)。因此，基于这三种肿瘤生物标记物的肝癌诊断或筛查具有重要的临床意义。具体地，本专利技术的第一方面提供血清外泌体微小RNAs作为肝癌生物标志物在制备肝癌检测试剂、肝癌检测试剂盒或者肝癌检测装置中的应用，其中，所述血清外泌体微小RNAs为以下三种微小RNA的组合：hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p。hsa-miR-203b-5p的序列：5’-UAGUGGUCCUAAACAUUUCACA-3’(SEQIDNO：5)，hsa-miR-219a-2-3p的序列：5’-AGAAUUGUGGCUGGACAUCUGU-3’(SEQIDNO：6)，hsa-miR-4661-5p的序列：5’-AACUAGCUCUGUGGAUCCUGAC-3’(SEQIDNO：7)。外参cel-miR-39-3p的序列：5’-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’(SEQIDNO：8)。本专利技术的第二方面提供一种基于血清外泌体微小RNAs的肝癌检测试剂盒，所述试剂盒包括检测物，所述检测物包括：与血清外泌体微小RNAhsa-miR-203b-5p特异性结合的检测物；与血清外泌体微小RNAhsa-miR-219a-2-3p特异性结合的检测物；与血清外泌体微小RNAhsa-miR-4661-5p特异性结合的检测物。根据本专利技术，所述检测物可以为任何能够与外泌体微小RNA特异性结合的物质，例如，可以为核酸。作为PCR扩增的引物实现检测。根据本专利技术一种优选实施方式，所述检测物包括：第一正向引物，针对所述hsa-miR-203b-5p逆转录后得到的cDNA设计：5’-TAGTGGTCCTAAACATTTCACA-3’(SEQIDNO：1)第二正向引物，针对所述hsa-miR-219a-2-3p逆转录后得到的cDNA设计：5’-AGAATTGTGGCTGGACATCTGT-3’(SEQIDNO：2)第三正向引物，针对hsa-miR-4661-5p逆转录后得到的cDNA设计：5’-AACTAGCTCTGTGGATCCTGAC-3’(SEQIDNO：3)外参cel-miR-39-3p正向引物，针对外参cel-miR-39-3p逆转录后得到的cDNA设计：5’-TCACCGGGTGTAAATCAGCTTG-3’(SEQIDNO：4)通用反向扩增引物。本专利技术中所述通用反向扩增引物的含义能够为本领域技术人员理解，是指能够与模板基因序列识别，并与前述任意正向引物一起都可以扩增得到一段预定长度产物的引物。所述通用反向扩增引物可根据常规的引物设计方法得到，也可以直接采用商品化的引物，例如，商品化反转录试剂盒中的通用反向扩增引物。根据本专利技术一种具体实施方式，所述反转录试剂盒中的通用反向扩增引物为Clontech公司Mir-XmiRNAFirst-StrandSynthesisKit(CodeNo.638315)中mRQ3’Primer。根据本专利技术，所述试剂盒还可以包括外泌体分离试剂、外泌体纯化试剂、阴性对照品、阳性对照品和RNA提取试剂中的至少一种。本专利技术通过抽取人的血液并对其中的血清外泌体hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p进行测量就可以实现肝癌的无创、非侵袭性筛查或者诊断，操作简单方便，具有较高特异性和敏感性。本专利技术的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。附图说明通过结合附图对本专利技术示例性实施方式进行更详细的描述，本专利技术的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。图1为通过对5例健康人和5例肝癌患者血清外泌体微小RNAs进行高通量测序得到的hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p表达差异倍数(FoldChange)图。(*表示P<0.05，**表示P<0.01)图2a-2c示出了通过qRT-PCR方法对8例健康人和8例肝癌患者血清外泌体中hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.血清外泌体微小RNAs作为肝癌生物标志物在制备肝癌检测试剂、肝癌检测试剂盒或者肝癌检测装置中的应用，其中，所述血清外泌体微小RNAs为以下三种微小RNA的组合：hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p。/n
【技术特征摘要】
1.血清外泌体微小RNAs作为肝癌生物标志物在制备肝癌检测试剂、肝癌检测试剂盒或者肝癌检测装置中的应用，其中，所述血清外泌体微小RNAs为以下三种微小RNA的组合：hsa-miR-203b-5p、hsa-miR-219a-2-3p和hsa-miR-4661-5p。
2.一种基于血清外泌体微小RNAs的肝癌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测物，所述检测物包括：
与血清外泌体微小RNAhsa-miR-203b-5p特异性结合的检测物；
与血清外泌体微小RNAhsa-miR-219a-2-3p特异性结合的检测物；
与血清外泌体微小RNAhsa-miR-4661-5p特异性结合的检测物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述检测物为核酸。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述检测物包括：
第一正向引物：5’-TAGTGGTCCTAAACATTTCACA-3’(...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋宇扬，陈妍，樊婷婷，孙钦升，李露露，张存龙，吴伟彬，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，深圳市坤健创新药物研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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