一种基于体外肿瘤细胞培养模型的灵芝质量评价方法技术

本发明专利技术涉及一种基于体外肿瘤细胞培养模型的灵芝质量评价方法，所述方法包括：取待测灵芝样品和阳性对照品配制成样品溶液和阳性对照溶液，稀释后混合或者分别与2D或3D培养的肿瘤细胞共孵育；孵育后的溶液中分别加入细胞活力指示剂反应，检测反应液的吸光度或荧光强度，计算其对肿瘤细胞增殖的抑制率，并计算相应的IC50或增长抑制率，以抑制率或增长抑制率评价灵芝质量。本发明专利技术基于体外培养的肿瘤细胞，通过测定灵芝对肿瘤细胞的抑制作用来评价其质量，检测指标与灵芝的抗肿瘤活性直接相关，可反映其临床疗效，因此可以更全面地评价灵芝的质量；肿瘤细胞3D培养与体内原位瘤更接近，评价结果更为准确，不涉及动物伦理学，分析流程短，分析成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种基于体外肿瘤细胞培养模型的灵芝质量评价方法(一)
本专利技术涉及一种基于体外肿瘤细胞培养模型的灵芝质量评价方法。(二)
技术介绍
中药质量控制对于确保中药产品的安全性、有效性和一致性有着重要意义，是中药现代化和国际化的关键。随着分析化学、药物分析学等相关学科的不断发展，中药质量评价技术取得了巨大进步，逐步形成了以化学检测为核心的质检技术体系，通过检测主要化学成分、指标性成分或活性成分等来评价中药产品的质量。但是，中药化学组成复杂且药效成分往往未知，测定一个或少数几个指标性成分难以真实反映大部分中药产品的质量，这也导致化学检测方法往往脱节于中药的药效和临床疗效。相较而言，生物活性检测与中药疗效具有更直接的联系。因此，通过检测中药的生物活性建立与药效相关的质量评价方法对于提高中药产品质量有重大现实意义，已成为中药质控领域的研究前沿。灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum或紫芝Ganodermasinense的干燥子实体，为我国传统珍稀名贵药材。《本草纲目》记载：灵芝性平，味苦，无毒，主胸中结，益心气，补中，增智慧，不忘，久服轻身不老，延年神仙。现代研究表明，灵芝具有抗肿瘤、免疫调节、强心、调节血脂、降血糖、保肝护肝等多种药理作用，临床上主要用于冠心病、高血脂症、高血压、糖尿病和肿瘤等疾病的治疗。灵芝具有多种化学成分，包括多糖、三萜、生物碱和脂肪酸等，其中多糖和三萜是其主要的活性成分。目前，灵芝的质量评价主要采用化学成分含量测定。例如2015版《中国药典》对灵芝的主要活性成分多糖、三萜及甾醇的含量进行了规定，其中多糖不得少于0.9％，三萜及甾醇不得少于0.5％。按照药典标准，这两种成分的总和加起来不到灵芝干重的1.5％，很难客观地评价灵芝的整体质量。期刊论文“基于UPLC-MS/MS多指标成分测定的灵芝质量评价(中国药师，2019,22(05)：844-848)”中，采用超高效液相色谱-串联质谱联用技术测定灵芝样品中灵芝酸C2、灵芝酸A、灵芝酸G、灵芝酸B、赤芝酸A和灵芝烯酸D的含量，并以6种成分的含量作为灵芝质量的评价指标。其检测方法为：以灵芝酸C2、灵芝酸A、灵芝酸G、灵芝酸B、赤芝酸A和灵芝烯酸D的混合溶液作为对照品，采用UPLC-MS/MS技术检测不同批次灵芝样品中灵芝酸C2、灵芝酸A、灵芝酸G、灵芝酸B、赤芝酸A和灵芝烯酸D的含量。该方法的缺点是：利用UPLC-MS/MS技术虽可快速测定灵芝样品中灵芝酸C2、灵芝酸A、灵芝酸G、灵芝酸B、赤芝酸A和灵芝烯酸D的含量，但这并不能直接反映各成分的生物活性，也无法全面反映灵芝药材的质量。专利申请号为CN201610821304.3的“一种赤灵芝药材的质量评价方法”中，采用液相色谱法测定灵芝药材样本中总灵芝三萜的含量，以总灵芝三萜含量作为评价赤灵芝药材质量优劣的质量标准。其评价方法是：以赤灵芝提取物对照品为对照，用液相色谱法在210nm～280nm的任意波长下测定待测赤灵芝药材样本，在得到的液相色谱图中对保留时间为15～65分钟区间的所有紫外吸收峰面积求和，并与赤灵芝提取物对照品中的灵芝酸A所对应的紫外吸收峰面积相比较，计算待测赤灵芝药材样本中总灵芝三萜含量。该方法的缺点是：用高效液相色谱法虽可快速测定灵芝药材中灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2和灵芝酸G的含量，并计算灵芝总三萜的含量，但含量并不能直接反映灵芝总三萜的生物活性，也无法全面反映灵芝药材的质量。专利申请号为CN201210382193.2的“一种评价灵芝提取物质量的新方法”中，以灵芝提取物的体外抗氧化活性作为评价灵芝质量的理化指标。其评价方法为：测定灵芝提取物样品清除DPPH阳离子自由基、ABTS+阳离子自由基、超氧阴离子自由基、羟基阴离子自由基的能力、总抗氧化的能力、还原铁离子的能力和螯合亚铁离子的能力，以抗氧化的半数有效浓度作为灵芝提取物质量定性的初步评价指标。该方法的缺点是：检测灵芝提取物的抗氧化活性，在一定程度上可以反映灵芝药材的质量，但是抗氧化活性与灵芝的临床应用和疗效的相关性不强。期刊论文“灵芝胶囊质量标准研究及质量评价(2005(09)：88-89)”中，以腺苷的含量作为灵芝胶囊的质量评判指标。其检测方法为：以腺苷溶液作为对照品，采用高效液相色谱发测定灵芝胶囊中腺苷的含量。该方法的缺点是：高效液相色谱法虽可准确检测灵芝胶囊中腺苷的含量，但腺苷的含量并不能全面地反映灵芝胶囊的活性以及质量。由于化学检测方法的缺陷，因此有必要建立基于药效作用或生物活性的方法更全面地评价灵芝及其产品质量。现代研究表明，灵芝具有良好的抗肿瘤活性，在临床上也可用于肿瘤的防治。因此，抗肿瘤活性可作为较理想的灵芝质量评价指标。在体外实验中，通常采用肿瘤细胞模型来评价药物对肿瘤的抑制作用。肿瘤细胞单层贴壁生长的二维(2-Dimensional,2D)培养模式是目前评价抗肿瘤药物活性的主要方法，该培养模式便捷、经济、易于操作，但缺乏体内细胞生长及分化的微环境，不能很好地模拟体内肿瘤细胞与肿瘤微环境间的相互作用，与动物实验和临床实验的结果可能存在一定的差异。肿瘤细胞体外三维(3-Dimensional,3D)培养模式是近年来发展起来的细胞培养新技术，与2D细胞培养和动物模型的体内研究相比，3D细胞培养模式可模拟细胞在人体内的生长环境，形成的多细胞球(Multicellularspheroids，MCS)具有与体内实体瘤相似的增殖曲线、梯度生理环境和耐药特征，研究周期短且无动物伦理学的争议，可更好地用于抗肿瘤活性评价。因此，2D和3D肿瘤细胞培养模型均可开发成为灵芝质量较为理想的评价方法。(三)
技术实现思路
针对以上不足，为更好的评价灵芝及其产品的质量，本专利技术构建肿瘤细胞的2D和3D体外培养模型，提供了一种基于体外肿瘤细胞培养模型的灵芝质量评价方法。本专利技术采用的技术方案是：一种基于体外肿瘤细胞培养模型的灵芝质量评价方法，所述方法包括：(1)取待测灵芝样品，用溶剂配制成样品溶液；(2)取阳性对照品，用溶剂配制成阳性对照品溶液；(3)构建肿瘤细胞的2D或3D培养模型，用培养液将样品溶液和阳性对照品溶液稀释成不同浓度，与肿瘤细胞共孵育；(4)分别吸除步骤(3)孵育后的溶液，加入新鲜的培养液，再加入细胞活力指示剂反应1～5h，采用酶联免疫检测仪检测反应液的吸光度或荧光强度，计算灵芝样品溶液、阳性对照品溶液对肿瘤细胞增殖的抑制率，并计算相应的IC50，以细胞增殖抑制率评价灵芝质量；所述细胞增殖抑制率的计算方法为：细胞增殖抑制率(％)＝[1-(OD样品组或阳性对照组-OD空白组/OD空白对照组-OD空白组)]×100％。或者，所述方法如下：(1)取待测灵芝样品，用溶剂配制成样品溶液；(2)取阳性对照品，用溶剂配制成阳性对照溶液；阳性对照溶液的终浓度为1～800ug/mL；(3)构建肿瘤细胞的2D或3D培养模型，用培养液(常规培养液，如DMEM等)将样品溶液和对照品溶液稀释成不同浓度，分别与肿瘤细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于体外肿瘤细胞培养模型的灵芝质量评价方法，所述方法包括：/n(1)取待测灵芝样品，用溶剂配制成样品溶液；/n(2)取阳性对照品，用溶剂配制成阳性对照品溶液；/n(3)构建肿瘤细胞的2D或3D培养模型，用培养液将样品溶液和阳性对照品溶液稀释成不同浓度，与肿瘤细胞共孵育；/n(4)分别吸除步骤(3)孵育后的溶液，加入新鲜的培养液，再加入细胞活力指示剂反应1～5h，采用酶联免疫检测仪检测反应液的吸光度或荧光强度，计算灵芝样品溶液、阳性对照品溶液对肿瘤细胞增殖的抑制率，并计算相应的IC50，以细胞增殖抑制率评价灵芝质量；所述细胞增殖抑制率的计算方法为：/n细胞增殖抑制率(％)＝[1-(OD

【技术特征摘要】
1.一种基于体外肿瘤细胞培养模型的灵芝质量评价方法，所述方法包括：
(1)取待测灵芝样品，用溶剂配制成样品溶液；
(2)取阳性对照品，用溶剂配制成阳性对照品溶液；
(3)构建肿瘤细胞的2D或3D培养模型，用培养液将样品溶液和阳性对照品溶液稀释成不同浓度，与肿瘤细胞共孵育；
(4)分别吸除步骤(3)孵育后的溶液，加入新鲜的培养液，再加入细胞活力指示剂反应1～5h，采用酶联免疫检测仪检测反应液的吸光度或荧光强度，计算灵芝样品溶液、阳性对照品溶液对肿瘤细胞增殖的抑制率，并计算相应的IC50，以细胞增殖抑制率评价灵芝质量；所述细胞增殖抑制率的计算方法为：
细胞增殖抑制率(％)＝[1-(OD样品组或阳性对照组-OD空白组/OD空白对照组-OD空白组)]×100％。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：
(1)取待测灵芝样品，用溶剂配制成样品溶液；
(2)取阳性对照品，用溶剂配制成阳性对照品溶液；
(3)构建肿瘤细胞的2D或3D培养模型，用培养液将样品溶液和阳性对照品溶液稀释成不同浓度，分别与肿瘤细胞共孵育；
(4)构建肿瘤细胞的3D培养模型，将培养液稀释后的样品溶液与对照品溶液混合，所得混合溶液与肿瘤细胞共孵育；
(5)分别吸除步骤(3)、(4)孵育后的溶液，加入新鲜的培养液，再加入细胞活力指示剂反应1～5h，采用酶联免疫检测仪检测反应液的吸光度或荧光强度，计算灵芝样品溶液、阳性对照品溶液和混合溶液对肿瘤细胞增殖的抑制率，并计算相应的IC50或增殖抑制率，以细胞增殖抑制率或增长抑制率评价灵芝质量；所述细胞增殖抑制率的计算方法为：
细胞增殖抑制率(％)＝[1-(OD样品组或阳性对照组-OD空白组/OD空白对照组-OD空白组)]×100％
增长抑制率(％)＝抑制率混合溶液-抑制率阳性对照品溶液。


3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为下列之一：肝癌细胞，乳腺癌细胞，结肠癌细胞，肺癌细胞，胃癌细胞，或胰腺癌细胞；所述阳性对照品为下列之一：氟尿嘧啶，顺铂，伊立替康，或多西紫杉醇；所述步骤(4)混合溶液中灵芝样品的浓度为0.001～10mg/mL。


4....

【专利技术属性】
技术研发人员：李振皓，潘海涛，张国亮，李振宇，赵建霞，周莎莎，
申请(专利权)人：浙江寿仙谷植物药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33