一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法技术

本发明专利技术涉及虫草素提取技术领域，具体公开了一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法，包括制备固体培养基和蚕蛹液，蚕蛹液涂布，条件差异培养提高培养基中虫草素含量，去除子实体，检测培养基中虫草素含量。本发明专利技术的方法在培养蛹虫草的过程中，大大提高了固体培养基中虫草素的积累量。

【技术实现步骤摘要】
一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法
本专利技术涉及虫草素提取
，具体涉及一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法。
技术介绍
虫草素学名为3′-脱氧腺苷，是从蛹虫草中提取出来的一种天然生物活性物质。虫草素的分子式为CsHyON，相对分子质量为251.25，能溶于水，乙醇，虫草素为含氮配糖体的核酸衔生物,属嘌呤类生物碱。虫草素是一种核甙类新药.20世纪70年代被发现有抑制肿瘤、抗疟原虫和抑制mRNA翻译的作用:20世纪90年代研究发现，添加腺甙脱氨酶(adenosinedeaminase,ADA)抑制剂对其抗肿瘤活性的表达起着重要作用。虫草素能干扰基因细胞RNA和DNA的合成,抑制癌细胞等不正常细胞的分裂,并能作为区别细胞中不同的RNA聚合酶的工具；同时，虫草素还表现出极强的抗真菌、抗HIV-I型病毒和选择性抑制梭菌的活性，引起医药学界的高度重视,虫草素在美国作为抗癌、抗病毒新药已经进人三期临末床。目前，虫草素获得的途径大部分通过子实体获得，然后这种途径相当昂贵，我们发现蛹虫草的发酵培养基中能够获得虫草素，且含量不比子实体中低，通过培养发酵获得虫草素，但是大部分通过培养基发酵均为液体发酵，但是液体发酵容易被污染，虽然固体培养能够降低污染率，但固体培养获得的虫草素含量低，通常低于1.8mg/g。因此，本专利技术提出一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法，通过在固体培养基表面涂布蚕蛹液以及条件差异培养大大提高了固体培养基中虫草素含量。本专利技术提供了一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法，包括以下步骤：S1，制备固体培养基和蚕蛹液，灭菌；所述固体培养基配方为：KH2PO41-5g，MgSO41-3g,维生素B12-7g,维生素B21-5g，葡萄糖2-3g，蛋白胨2-4g，蚕蛹粉4-6g，大米4-12g，玉米渣2-4g，荞麦粉2-6g，椰子壳颗粒2-5g，蒸馏水100-300ml，pH调至6.2-8.3；所述蚕蛹液由蚕蛹粉、甘氨酸、腺嘌呤和蒸馏水混合而成；将上述固体培养基分装后与蚕蛹液置于121℃下灭菌20-30min；S2，接种前在固体培养基中加入蚕蛹液并涂布均匀；S3，通过条件差异培养提高培养基中虫草素含量：将提前备好的产虫草素菌种接种于固体培养基中，于14-20℃下黑暗培养6-10d后，调节培养温度至18-30℃继续黑暗培养14-20d，然后进行昼夜变换培养；所述昼夜交替培养具体为：白天在温度18-30℃、光照200-500lx下进行培养12-14h，夜间在黑暗条件，温度为10-12℃下培养10-12h；上述所述昼夜交替培养时间为8-12d；然后调整光照为1000-2500lx，温度于18-30℃下继续培养2-4d；S4，去除S2中培养基中的子实体，检测培养基中虫草素含量。优选的，所述固体培养基中的椰子壳颗粒是由椰子壳粉碎成粒径为5-7mm的颗粒。优选的，所述蚕蛹粉、甘氨酸、腺嘌呤和蒸馏水混合用量比为1g：1g：1g：100-200ml。优选的，S1中，所述固体培养基分装在培养罐中，分装量为18-22g/罐。优选的，S2中，所述蚕蛹液添加量为40-60μl/罐。优选的，S3中，所述菌种为蛹虫草。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术提供方法，有效的提高了固体培养基中虫草素含量，固体培养基中虫草素平均含量高达7.06mg/g。2、本专利技术中所用固体培养基配方中各种物质相互协同促进虫草素的积累，其中，椰子壳的添加能够增加固体培养基内部的孔隙度，不仅在空间上有利于蛹虫草的生长，同时还能提供碳源。3、本专利技术通过由蚕蛹粉、甘氨酸、腺嘌呤和蒸馏水混合而成的蚕蛹液在接种前添加至固体培养基表面，促进虫草素在早期的产生，最终提高了固体培养基中虫草素含量。4、本专利技术还通过条件差异培养提高了固体培养基中虫草素含量。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术虫草素标准品的色谱图；图2为本专利技术实施例1固体培养基中获得的虫草素色谱图；图3为本专利技术实施例1-3和对比例1-3获得的虫草素单位含量比较图。具体实施方式下面对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1：(1)蛹虫草液体菌种的获得：将菌种无菌接种至PDA培养基中，于21℃恒温光照培养18d后，用灭菌牙签挑取分生孢子接种至PD培养液中，于170r/min，21℃恒温摇培4d，获得种子培养液；然后将上述种子培养液按照质量比4％接种至发酵罐放大培养，通气量为1.0m3/h，罐压力为1.1MPa，发酵温度为25℃，发酵时间为5d，的得到用于固体培养的蛹虫草菌种。PDA液体培养基(g/L)：马铃薯200克葡萄糖20克，1000ml蒸馏水，pH6.3；PD液体培养基(g/L)：马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨3g、KH2PO42g、MgSO4·7H2O1g，复合维生素B25mg，1000ml蒸馏水，pH6.3。(2)一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法，包括以下步骤：S1，制备固体培养基和蚕蛹液，灭菌；所述固体培养基配方为：KH2PO41g，MgSO41g,维生素2g,维生素B21g，葡萄糖2g，蛋白胨2g，蚕蛹粉4g，大米4g，玉米渣2g，荞麦粉2g，椰子壳颗粒2g，蒸馏水100ml，pH调至6.2；所述椰子壳颗粒是由椰子壳粉碎成粒径为5mm的颗粒；所述蚕蛹液由蚕蛹粉、甘氨酸、腺嘌呤和蒸馏水按照用量比为1g：1g：1g：100ml混合而成；将上述固体培养基按照分装量18g/罐分装在培养罐中，然后和蚕蛹液一同置于121℃下灭菌20min；S2，接种前在培养罐中的固体培养基表面加入40μl蚕蛹液并涂布均匀；S3，通过条件差异培养提高培养基中虫草素含量：将提前备好的蛹虫草菌种接种于固体培养基中，于14℃下黑暗培养6d后，调节培养温度至18℃继续黑暗培养14d，然后进行昼夜变换培养；所述昼夜交替培养具体为：白天在温度18℃、光照200lx下进行培养12h，夜间在黑暗条件，温度为10℃下培养10h；上述所述昼夜交替培养时间为8d；然后调整光照为1000lx，温度于18℃下继续本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1，制备固体培养基和蚕蛹液，灭菌；/n所述固体培养基配方为：KH

【技术特征摘要】
1.一种利用固体培养基获得高产虫草素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，制备固体培养基和蚕蛹液，灭菌；
所述固体培养基配方为：KH2PO41-5g，MgSO41-3g,维生素B12-7g,维生素B21-5g，葡萄糖2-3g，蛋白胨2-4g，蚕蛹粉4-6g，大米4-12g，玉米渣2-4g，荞麦粉2-6g，椰子壳颗粒2-5g，蒸馏水100-300ml，pH调至6.2-8.3；
所述蚕蛹液由蚕蛹粉、甘氨酸、腺嘌呤和蒸馏水混合而成；
将上述固体培养基分装后与蚕蛹液置于121℃下灭菌20-30min；
S2，接种前在固体培养基中加入蚕蛹液并涂布均匀；
S3，通过条件差异培养提高培养基中虫草素含量：
将提前备好的产虫草素菌种接种于固体培养基中，于14-20℃下黑暗培养6-10d后，调节培养温度至18-30℃继续黑暗培养14-20d，然后进行昼夜变换培养；
所述昼夜交替培养具体为：白天在温度18-30℃、光照200-500lx下培养12-14h，夜间在黑暗条件，温度为10...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓红，
申请(专利权)人：辽东学院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21