一种利用甲醇还原NAD类似物的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用甲醇还原NAD类似物的方法及其应用。该方法中还原剂为甲醇，催化剂为可利用甲醇的甲醇脱氢酶，甲醇脱氢酶氧化甲醇的同时，将NAD类似物转化为其还原态。该方法可用于生产还原态NAD类似物或氘代的还原态类似物，也可为消耗还原态NAD类似物的酶促反应提供还原态辅酶，还原态的NAD类似物可作为辅酶应用于苹果酸酶ME‑L310R/Q401C、D‑乳酸脱氢酶DLDH‑V152R、酿酒酵母醇脱氢酶等酶催化的还原反应，有利于NAD类似物的广泛应用。该NAD类似物还原方法可在温和条件下，再生还原态NAD类似物用于苹果酸或乳酸的制备；也可作为一种氧化还原力调控微生物体内苹果酸或乳酸的代谢强度。

【技术实现步骤摘要】
一种利用甲醇还原NAD类似物的方法
本专利技术属于生物
，涉及辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)类似物的酶催化还原方法及其应用，具体地说，是以甲醇为还原剂，在酶催化下将NAD类似物转化为其还原态，并可被其他酶用做辅酶应用于还原反应。
技术介绍
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其还原态NADH是生命过程中的重要辅酶，参与生命体中的一系列氧化还原代谢及其他的重要生物化学过程。这些辅酶可用于生产手性化学品及制备同位素标记物。由于很多氧化还原酶都利用NADH或NADPH作为辅酶，任何改变NAD浓度及其氧化还原状态的操作都会对细胞产生全局性影响，很难在辅酶水平对生物体系中特定的氧化还原酶进行控制。由于NADH可被代谢网络中的多种途径消耗，影响了目标途径对还原力的利用效率。使用NAD类似物传递还原力时，由于类似物只能被突变型氧化还原酶识别，从而在辅酶水平对目标氧化还原过程进行调控，对生物催化和合成生物学研究具有重要意义(JiDB,etal.JAmChemSoc,2011,133,20857-20862；WangL,etal.ACSCatal，2017,7,1977-1983)。目前已经报道了几种具有良好生物相容性的NAD类似物。如，烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)、烟酰胺胸腺嘧啶二核苷酸(NTD)、烟酰胺尿嘧啶二核苷酸(NUD)(JiDB,etal.JAmChemSoc,2011,133,20857-20862；JiDB,etal.SciChinaChem,2013,56,296-300)。同时，也报道了一些可识别NAD类似物的酶，如来自粪肠球菌Enterococcusfaecalis的NADH氧化酶(NOX，GenbankS45681)、D-乳酸脱氢酶(DLDH，GenbankCAA47255)V152R突变体、苹果酸酶(ME，GenbankP26616)L310R/Q401C突变体、苹果酸脱氢酶(MDH，GenbankCAA68326)L6R突变体。利用NAD类似物及识别它们的酶，可以构建更经济有效的生物催化体系(纪德彬等.催化学报,2012,33,530-535)。通过选择合适的NAD类似物及识别它们的酶，可利用粗酶液进行反应达到纯酶催化的效果，实现在辅酶水平控制复杂生物催化转化体系。目前，已经实现利用NAD类似物进行胞内代谢反应的调控，通过向胞内转运NCD，DLDH-V152R可利用NCD将丙酮酸还原为乳酸，实现了特异性的生物催化调控(WangL,etal.ACSCatal,2017,7,1977-1983)。和使用其他氧化还原辅酶一样，NAD类似物也必需再生循环。辅酶再生方式主要有酶法、电化学法、化学法和光化学法。其中酶法具有选择性高、可以与合成酶兼容及高转换数等优点。甲醇脱氢酶可以利用甲醇，将甲醇转化成甲醛，在微生物细胞中甲醛可以通过细胞内源的甲醛脱氢酶催化，转化成甲酸或者进入核糖酮单磷酸途径、四氢甲烷蝶呤途径等，产生细胞生命活动必须的代谢物和还原力，从而实现一碳资源的有效利用(MüllerJE,etal.MetabEng,2015,28,190-201；ZhangW,etal.RSCAdv,2017,7,4083–4091)。虽然NAD类似物再生循环对生物催化和合成生物学等领域具有重要意义，但是目前通过改造酶的结构来高效还原NAD类似物的文献很少，尚没有文献报道如何改造甲醇脱氢酶来高效还原NAD类似物。已报道的NAD类似物还原方法(赵宗保等,一种NAD类似物的还原方法.中国专利201010524767.6)利用亚磷酸脱氢酶，以亚磷酸为底物，将NAD类似物还原成NADH，同时生成副产物磷酸。与亚磷酸脱氢酶催化亚磷酸化合物生成产物磷酸化合物相比，甲醇脱氢酶的底物甲醇来源丰富价格低廉，是具有较大前景的一碳化合物，利用微生物细胞，甲醇可以被甲醇脱氢酶还原最终生成高附加值化合物(WhitakerWB,etal.MetabEng,2017,39,49-59)。因此，通过甲醇脱氢酶还原甲醇实现NAD类似物的再生是将一碳资源利用和NAD类似再生相结合的新的还原方法，在实现NAD类似物还原的同时，利用一碳化合物甲醇实现碳的转化和能量的传递。基于以上背景和优势，在已有的利用甲醇及其衍生物还原NAD类似物的方法基础上，本专利技术利用的定向进化的方法，以获得对NAD类似物还原效率进一步提升的突变体。
技术实现思路
本专利技术涉及一种辅酶NAD类似物的酶催化还原方法，具体来说，以甲醇、氘代甲醇中的一种或者两种的任意比例组合的底物为还原剂，可利用该还原剂的酶为催化剂，将NAD类似物转化为相应的还原态。这些NAD类似物还原态可作为其他氧化还原酶的辅酶，用于还原反应。因此，本专利技术的方法可应用在生物催化和生物转化领域，具有重要价值。本专利技术涉及一种利用甲醇还原NAD类似物的方法，其特征在于：以甲醇、氘代甲醇中的一种或者两种的任意比例组合的底物为还原剂，以可利用甲醇的酶为催化剂，在pH4-9的缓冲体系中，反应温度15-40℃，酶的终浓度为1μg/mL-600μg/mL，NAD类似物的终浓度为0.001mM-20mM、甲醇化合物的终浓度为1mM-1000mM下，反应2-120min，获得还原型NAD类似物。所述的缓冲体系包括但不限于磷酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液，HEPES缓冲液，MES缓冲液，PIPES缓冲液，乙酸-乙酸钠缓冲体系中的一种或两种以上。NAD类似物包括NCD、烟酰胺胸腺嘧啶二核苷酸(NTD)和烟酰胺尿嘧啶二核苷酸(NUD)，他们具有如下的化学结构：本专利技术涉及的NAD类似物参照文献方法(JiDB,etal.SciChinaChem,2013,56,296-300)制备。本专利技术使用的甲醇脱氢酶为具有以甲醇为还原剂，催化还原NAD类似物为相应还原态的活性蛋白质。这些酶为来源于Bacillusstearothermophilus的甲醇脱氢酶BsMDH(NCBI蛋白数据库编号P42327.1，含1至339位完整氨基酸序列)的突变体(突变位点用氨基酸序号和突变前后的氨基酸名称表示，如V237T表示第237位氨基酸由V突变成T，其余位点类似)，包括突变体BsMDH-V237T/N240E，BsMDH-V237T/N240E/K241A，BsMDH-Y171R/V237T/N240E/K241A，BsMDH-Y171R/I196V/V237T/N240E/K241A。V237T代表第237位氨基酸由V突变成T，N240E代表240位的氨基酸由N突变为E，其它类同。这些酶的表达和纯化参照在大肠杆菌中表达其他氧化还原酶的文献方法进行(JiDB,etal.JAmChemSoc,2011,133,20857)。本专利技术涉及的NAD类似物和NAD一样含有烟酰胺单核苷酸单元，该单元的还原态为1,4-二氢烟酰胺单核苷酸。因此，NAD类似物还原态产物在340nm附近的紫外光谱区有较强吸收，摩尔消光系数ε340约为6220M-1·cm-1(JiDB,etal.Creationofbioorthogona本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NAD类似物的还原方法，其特征在于：以甲醇、氘代甲醇中的一种或者两种的任意比例组合的底物为还原剂，可利用该还原剂的酶为催化剂，与NAD类似物混合，反应获得还原型NAD类似物，同时甲醇氧化成甲醛；催化剂为野生型甲醇脱氢酶Bacillusstearothermophilus,DSM 2334(ADH 2334)经基因工程改造的突变体；可利用甲醇的酶为甲醇脱氢酶突变体BsMDH-V237T，BsMDH-V237T/N240E，BsMDH-V237T/N240E/K241A，BsMDH-Y171R/V237T/N240E/K241A，BsMDH-Y171R/V237T，BsMDH-Y171R/I196E，BsMDH-Y171R/I196V/V237T/N240E/K241A，BsMDH-Y171R，BsMDH-Y171R/N240E，BsMDH-Y171R/I196E/V237T/N240E/K241A，BsMDH-V237T/N240V/K241A，BsMDH-Y171R/I196R/V237T/N240E中的一种或两种以上。/n

【技术特征摘要】
1.一种NAD类似物的还原方法，其特征在于：以甲醇、氘代甲醇中的一种或者两种的任意比例组合的底物为还原剂，可利用该还原剂的酶为催化剂，与NAD类似物混合，反应获得还原型NAD类似物，同时甲醇氧化成甲醛；催化剂为野生型甲醇脱氢酶Bacillusstearothermophilus,DSM2334(ADH2334)经基因工程改造的突变体；可利用甲醇的酶为甲醇脱氢酶突变体BsMDH-V237T，BsMDH-V237T/N240E，BsMDH-V237T/N240E/K241A，BsMDH-Y171R/V237T/N240E/K241A，BsMDH-Y171R/V237T，BsMDH-Y171R/I196E，BsMDH-Y171R/I196V/V237T/N240E/K241A，BsMDH-Y171R，BsMDH-Y171R/N240E，BsMDH-Y171R/I196E/V237T/N240E/K241A，BsMDH-V237T/N240V/K241A，BsMDH-Y171R/I196R/V237T/N240E中的一种或两种以上。


2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述被还原的NAD类似物为为烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)、烟酰胺胸腺嘧啶二核苷酸(NTD)或烟酰胺尿嘧啶二核苷酸(NUD)，其化学结构如下：





3.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述可利用甲醇的酶为具有以甲醇为还原剂，催化还原NAD类似物为相应还原态的活性蛋白质。


4.按照权利要求1所述NAD类似物的还原方法，其特征还在于：在pH4-9的缓冲液中，反应温度15-40℃，初始酶终浓度为1μg/mL-600μg/mL、NAD类似物初始浓度为0.001m...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵宗保，王俊婷，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21