一种红花檵木查尔酮异构酶LcCHI基因及其应用制造技术

从红花檵木中克隆获得查尔酮异构酶同源基因LcCHI。LcCHI基因的开放阅读框长度为657bp，编码218个氨基酸。红花檵木LcCHI与包括玫瑰、月季在内的多种植物CHI的氨基酸序列同源性很高。CHI负责酶催化活性的5个氨基酸残基位点也在不同植物的CHI氨基酸序列中高度保守。LcCHI蛋白的三级结构主要由8个α螺旋和11个β折叠片层形成的球状蛋白，其催化核心区域具有两个硝酸根配基结合位点。成功构建LcCHI的过表达载体，在拟南芥中异源表达并获得基因过表达的转基因株系，为该基因功能分析鉴定基础。红花檵木LcCHI基因的克隆和转基因研究可为红花檵木中类黄酮生物合成分子机制奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种红花檵木查尔酮异构酶LcCHI基因及其应用
本专利技术所提供的查合酮异构酶基因是首次从红花檵木中克隆获得的。黄酮类物质是一种重要的植物次生代谢产物。查尔酮异构酶基因是黄酮类物质生物合成途径中的第二个限速酶类。该基因的成功克隆，为红花檵木的品种选育提供重要依据，也为黄酮类化合物富集的转基因植物株系研究提供基础。
技术介绍
本专利技术通过转录组测序的方法获得红花檵木查尔酮异构酶的cDNA序列，PCR扩增得到查尔酮异构酶的ORF全序列。利用本专利技术可以对红花檵木进行基因工程改造，利用转基因的方法对将LcCHI转化到红花檵木中，以红花檵木中包括花青苷在内的黄酮类物质含量的提高；或者利用该基因进行红花檵木品种筛选与鉴定，得到高黄酮含量的植物品种等，为红花檵木中特定的目的次生代谢产物富集的提供基础。在红花檵木中克隆到查尔酮异构酶基因，是研究红花檵木中黄酮类物质合成途径的基础，能够为红花檵木品种选育提供理论依据，也为黄酮类物质含量高的转基因株系研究提供基础。
技术实现思路
红花檵木(Loropetalumchinensevar.rubrum)是我国特色的观花观叶植物，其花、叶中均可合成花青苷物质而显红色。红花檵木的红色叶片具有较高的观赏价值，但我国南方地区夏季持续高温会导致其叶片颜色由红变绿，观赏价值严重降低。目前，利用生理学研究方法对红花檵木叶色变化的机制开展了一些研究，并获得了红花檵木叶片响应高温、湿度和干旱条件下的叶色变化机制。然而，尚未有红花檵木中花青苷物质合成分子机制的研究，花青苷合成途径基因的克隆目前只有LcCHS基因得到克隆。因此，开展红花檵木花青苷形成的分子机制的研究，筛选花青苷合成酶相关基因及功能鉴定，对于红花檵木的叶色育种有重要的意义。在植物花青苷生物合成途径中，多个催化酶类参与了花青苷物质的合成。查尔酮异构酶(chalconeisomerase，CHI)直接催化底物查尔酮形成二氢黄酮，是花青苷物质合成途径的第二个限速酶类，也影响了其他5种黄酮类物质(包括黄酮醇类、黄烷酮类、黄酮类、异黄酮类、黄烷醇类)的积累。因此，克隆出红花檵木的LcCHI基因并对其功能进行研究，为红花檵木花青苷生物合成途径的研究提供基础，能够为红花檵木花色育种提供重要依据，也为黄酮类化合物富集的转基因植株研究提供物质。2.1红花檵木查尔酮异构酶(以下均称为LcCHI)编码基因的克隆1)红花檵木叶片RNA的提取及反转录第一链cDNA以红花檵木叶片为材料，利用北京艾德莱生物科技有限公司的植物多糖多酚试剂盒，按照其操作方法提取RNA，获得了红花檵木叶片的总RNA，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测(附图1：红花檵木总RNA电泳图)，结果表明，红花檵木RNA的28S和18S条带清晰，质量较好。利用生工生物(上海)股份有限公司的M-MuLV逆转录酶合成第一链cDNA，反应步骤如下：试剂：总RNA7μl，Oligo(dT)182μl，DEPC水1.5μl，总体积11.5μl混匀后，65℃水浴锅孵育5min，放置于冰上冷却。按指定顺序加入以下组分：试剂：5×ReactionBuffer4μl，Rnaseinhibitor0.5μl(20U)，dNTPmix，2.5mMeach4μl，M-MuLVReverseTranscriptase1μl(200U)；总体积20μl。轻轻混匀后短暂离心。42℃，1h；72℃10min终止反应。即获得红花檵木第一链cDNA。2.2红花檵木LcCHI基因的分子克隆基于转录组测序结果，利用PrimerPremier5.0软件，设计了可以克隆到红花檵木LcCHI基因开放阅读框(Openreadingframe，ORF)序列的特异引物，上游引物CHS-LP的核苷酸序列为：5'-GATTCGTTTTCAATCACCA-3'，下游引物CHS-RP的核苷酸序列为：5'-AACCATCAGCATTTCCCTGT-3'。PCR扩增红花檵木LcCHI的cDNA序列，利用BBI的TaqPCR预混液(2×)进行PCR，反应体系如下：试剂：TaqPCRMasterMix12.5μl，CHS-LP0.7μl，CHS-RP0.7μl，cDNA0.3μl，ddH2O10.8μl；总体积25μl。反应程序为：94℃3min；94℃30s，51℃30s，72℃1min，35个循环反应；72℃2min。1％琼脂糖凝胶电泳检测，获得了红花檵木LcCHI的cDNA片段(附图2：红花檵木LcCHI的cDNA序列扩增)。PCR产物直接送华大基因进行第一代测序，测序引物分别为CHI-LP和CHI-RP。将测序结果与转录组测序结果进行比对，确定了红花檵木的开放阅读框序列。红花檵木LcCHI基因的ORF序列全长为657bp，编码218个氨基酸序列。红花檵木LcCHI的开放阅读框的核苷酸序列如下所示：红花檵木LcCHI基因的编码氨基酸序列如下所示：2.3红花檵木LcCHI基因的生物信息学分析利用以下步骤对红花檵木LcCHI基因进行生物信息学分析：2.3.1将LcCHI的ORF序列在NCBI的在线软件BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行BlastX，获得了与LcCHI同源性高的多个植物查尔酮异构酶，并下载其中的5个同源CHI基因。利用DNAMAN软件对红花檵木LcCHI及其他5种植物CHI的编码氨基酸进行序列比对，结果表明，红花檵木LcCHI与来源于玫瑰RrCHI(AKT71851.1)、月季RcCHI(XP_024176829.1)、茶树CsCHI(ASU87415.1)、美洲葡萄VlCHI(ACS36662.1)和樱桃李PcCHI(AKV89240.1)的氨基酸序列进行同源性均很高，氨基酸的一致性均在75％以上(附图3：红花檵木LcCHI氨基酸序列比对)，可见LcCHI基因在进化上高度保守。对LcCHI保守氨基酸进行分析，发现5个氨基酸残基Arg(38)、Thr(46)、Tyr(108)、Asn(115)和Ser(192)执行LcCHI酶的催化活性。2.3.2使用Mega6.0软件，对红花檵木LcCHI氨基酸序列，以及来源于红花檵木LcCHI、玫瑰RrCHI、月季RcCHI、茶树CsCHI、美洲葡萄VlCHI、樱桃李PcCHI、橄榄CaCHI(AEO36936.1)、龙眼DlCHI(AEO36980.1)、美洲葡萄VlCHI(ACS36662.1)、牡丹PsCHI(AEK70330.1)、芍药PlCHI(AEK32592.1)、烟草NtCHI(NP_001312216.1)、矮牵牛PhCHI(CAA32730.1)、水稻OsCHI(AAM13448.1)和玉米ZmCHI(NP_001144002.2)的氨基酸序列进行系统进化树构建(附图4：系统进化树构建)。红花檵木LcCHI的序列与玫瑰、月季、樱桃李等木本植物的同源性更高。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种来源于红花檵木的查尔酮异构酶基因，其特征在于，所述查尔酮异构酶基因的核苷酸序列如下所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种来源于红花檵木的查尔酮异构酶基因，其特征在于，所述查尔酮异构酶基因的核苷酸序列如下所示。


2.ATGGCTAAAGTACTGCACGTCACCGGAGTTCAGGTCGAGAACGTTACATTCCCACCGACG60
GTGAAGCCTCCTGGCTCGACCAACACCTTGTTCCTCGGTGGCGCAGGGGAGAGGGGTTTG120
GAAATTCAAGGGAAGTTCGTGAAGTTCACAGCCATAGGGGTTTACTTAGAAGATAATGCC180
GTTCCGTCCCTCGCCGTTAAGTGGAAGGGGAAGACTGCGGAGGAGTTGACGGAATCCGTC240
GAGTTCTTCAGGGATATCGTTACAGGTCCCTTTGAGAAATTCACACGGGTGACTATGATC300
TTGCCATTAACTGGGCAGCAATATTCAGAGAAGGTGGCAGAAAATTGCGTCGCCATTTGG360
AAAGCTCTGGGAATTTACACTGATGCAGAGGCCAAAGCCATTGAGAAGTTCACTGAGGTC420
TTCAAGGATGAAACCTTTCCACCTGGTGGCTCTATTCTTTTCACACAGTCACCCCTCGGA480
TCATTAACGATTGGCTTCTCCAAAGATGGGTGTGTACCAGAAGTTGGGAAGGCAGTAATA540
GAGAATAAACTACTTTCAGAGGCAGTACTGGAGTCAATCATAGGCAAGCATGGTGTTTCT600
CCTGTAGCCAAGCAGTCTTTGGCTACTAGATTATCTGAATTATTGAAGGAGGCCTAG657。


3.如1所示的红花檵木的查尔酮异构酶基因，其氨基酸序列如下所示：
MetAlaLysValLeuHisValThrGlyValGlnValGluAsnValThrPheP...

【专利技术属性】
技术研发人员：张邦跃，
申请(专利权)人：湖南工业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43