ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用制造技术

ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，涉及人医药技术领域，本发明专利技术公开了血管紧张素转化酶II（ACE2）受体保护短肽的氨基酸顺序及其赖氨基酸和C‑16脂肪酸修饰后在预防和治疗新型冠状病毒（SARS‑CoV‑2）感染的应用，同时，从分子、细胞及动物水平检测了这些融合的短肽能高效和特异性靶向阻断SARS‑CoV‑2‑S蛋白RBD与ACE2受体相互作用，最终，以鼻内给药方式予ACE2保护性短肽阻止了病毒侵入靶细胞，1、C6KRBD‑GZ5：[C‑16]KKKKKKYLYRLF；2、C6KRBD‑GZ26：KKKKKKYK[C‑16]YRYLRHGKLR；3、C6KRBD‑GZ28：KKKKKK[C‑16]VEGFVEGFNCYFPLQS。

【技术实现步骤摘要】
ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用
本专利技术涉及人医药
，尤其是涉及ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用。
技术介绍
公知的，世界卫生组织将新型冠状病毒肺炎命名为2019年冠状病毒病(COVID-19)，截至2020年5月，迄今为止尚无有效治疗COVID-19的特异性小分子及蛋白短肽药物，最新研究表明新型冠状病毒（SARS-CoV-2）与SARS-CoV一样，通过S蛋白与人细胞表面ACE2受体的相互作用进行病毒内吞，感染人呼吸道上皮细胞，据报道，ACE2的完整分子和/或其跨膜区，作为SARS特异性受体在感染时与SARS-CoV外壳一起被内吞，此过程对病毒感染至关重要，因此，特异性靶向阻断SARS-CoV-2-S蛋白结合ACE2将是预防和治疗COVID-19有效策略，本研究首次针对SARS-CoV-2-S蛋白RBD的新突变氨基酸残基序列，设计保护人源ACE2蛋白短肽，并在N末端添加赖氨酸修饰，计算机模拟显示，3个短肽具有ACE2高非酶活性位点亲和力，因此，本研究拟用C-16脂肪酸与合成短肽融合增效，并从分子、细胞以及动物水平检测这些短肽能否高效并特异性靶向阻断SARS-CoV-2-S蛋白RBD与ACE2相互作用，最终，为临床预防和治疗SARS-CoV-2感染提供新的思路和科学依据。ACE2受体蛋白是SARS-CoV-2感染的关键分子，潜在的ACE2受体结合(保护)剂就有望成为新型冠状病毒感染的治疗药物，普遍认为，从病毒进入细胞、复制、产生子代的整个病毒生命周期来看，病毒如何进入细胞是关键，SARS-CoV-2病毒表面S蛋白是病毒进入细胞的关键“钥匙”，可以打开细胞受体ACE2蛋白的“锁”，从而进入细胞并启动其复制过程。因此，本项目拟研发ACE2受体保护性蛋白短肽，通过识别和阻断这个“钥匙”与“锁”的结合而达到阻断病毒进入细胞的作用。在前期阿尔海默兹病（AD）合成短肽药物的相似研究工作中，我们意外惊奇发现在人载脂蛋白ApoE-LDL受体结合域(RBD)的短肽N-末端额外添加6个赖氨酸所形成的新短肽能够特异性阻断ApoE介导的淀粉样前体蛋白(APP)的内吞作用，并且不影响APPα-分泌酶切割，此外，在C-16脂肪酸融合这一新短肽后，非常显著地增强其对蛋白酶消化的抵抗能力以及与其受体的结合能力，经过生物学实验已证实该短肽能有效阻断内源性ApoE蛋白与APP病理性结合，减少AD样病理变化，改善认知功能。研究表明SARS-S1蛋白包含一个与ACE2蛋白有着高亲和性的受体结合区域(RBD)，特别是RBD氨基酸残基424-492主要负责识别细胞的受体，2012德国的研究团队设计和发现了SARS-S蛋白RBD短肽(Y438-L443)能抑制ACE2与SARS-CoV的S蛋白结合，阻止了其病毒与靶细胞的融合，最新的研究表明SARS-CoV-2亦含有该受体结合区域，用于与ACE2受体蛋白的结合及后续的细胞膜融合，SARS-S蛋白RBD进行同源性比较，德国团队还发现SARS-CoV-2-S蛋白RBD包含21个变异氨基酸残基，其中14个变异分别在集中在Y452-K463和V484-S495氨基酸残基，但未进行变异位点阻断的后续研究，基于此，这些差异是否会影响SARS-CoV-2的宿主选择性和传播能力值得进一步研究。
技术实现思路
为了克服
技术介绍
中的不足，本专利技术公开了ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，本专利技术通过设计了28个SARS-CoV-2-S蛋白质RBD区域蛋白短肽(覆盖N440-S495)，同时分别对这些短肽进行了N末端添加赖氨酸修饰，对这些修饰后的短肽进行了短肽与人ACE2受体蛋白结合对接分析，从分子、细胞以及动物水平检测这些脂肪酸化的合成短肽能否高效并特异性靶向阻断SARS-CoV-2-S蛋白RBD与ACE2受体相互作用，最终，为研发ACE2保护性短肽用以防止其病毒感染，进一步为临床预防和治疗SARS-CoV-2感染提供新的思路和科学依据。ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，包括对所有合成并且修饰的短肽进行计算机模拟短肽-ACE2受体蛋白结合对接分析，以筛选出与人ACE2受体蛋白亲和力最高的短肽；进一步，通过不同蛋白和/或脂肪酸修饰短肽，获得SARS-CoV-2不同阻断强度候选库，并在体外模型中测试不同修饰短肽对SARS-CoV-2的阻断效果；进一步，采用人源ACE2受体（hACE2）转基因小鼠模型，在体内模型中测试不同修饰的短肽对SARS-CoV-2的阻断作用；进一步，分子水平研究C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26、C6KRBD-GZ28和C6K（对照）合成短肽在无细胞系统中是否能抑制重组SARS-CoV-2-S蛋白RBD与ACE2受体结合；进一步，在无细胞系统中首先确认重组SARS-CoV-2-S蛋白RBD与人ACE2受体的结合情况重组SARS-CoV-2-S蛋白（nS蛋白），将其与人重组ACE2受体蛋白于37℃孵育0.5-4小时，然后与鼠或兔抗人ACE2抗体在4℃进行免疫沉淀孵育5-15小时，通过WB检测nS蛋白与ACE2受体结合情况；进一步，在无细胞系统中确认C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26和C6KRBD-GZ28合成短肽与人重组ACE2受体蛋白的结合情况将合成的短肽（包括对照C6K短肽）分别与人ACE2受体蛋白于37℃孵育0.5-2.5小时，然后与鼠或兔抗人ACE2抗体在4℃进行免疫沉淀孵育5-15小时。通过WB检测每一种合成短肽和ACE2受体结合情况；进一步，在无细胞系统中进一步确认C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26和C6KRBD-GZ28合成短肽分别竞争性抑制重组SARS-CoV-2-S蛋白RBD与ACE2受体结合情况在浓度均为100nM的合成短肽和重组nS蛋白情况下，将每一种合成短肽（包括C6K对照短肽）分别与重组nS蛋白和人ACE2受体同时在37℃孵育0.5-1.5小时，然后与鼠或兔抗人ACE2抗体在4℃进行免疫沉淀孵育5-15小时，通过WB检测每一种短肽和ACE2受体蛋白结合情况；进一步，从细胞功能水平研究C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26、C6KRBD-GZ28和C6K合成短肽在II型人肺泡上皮（AT2）细胞中是否能阻止重组SARS-CoV-2-S蛋白RBD与ACE2受体蛋白结合，以及减轻或阻断其诱导的与SARS-CoV-2感染及复制相关基因表达水平；进一步，ELISA检测合成短肽在AT2细胞中竞争性抑制重组SARS-CoV-2-S蛋白RBD与ACE2受体结合情况，在正常生理情况下，ACE2催化并灭活血管紧张素II，并产生血管扩张肽血管紧张素1-7(Ang1-7)，按照细胞株公司提供的培养条件，在24孔板（5X106/孔）中培养AT2细胞，分别加入每种合成短肽、ACE2蛋白受体抑制剂DX600和ACE2蛋白受体激活剂黄酮孵育0.5-3小时后，置于不同浓度的重组nS蛋白下处理1-4小时，然后分别再添加人血管紧张素II并继续本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，包括对所有合成并且修饰的短肽进行计算机模拟短肽-ACE2受体蛋白结合对接分析，以筛选出与人ACE2受体蛋白亲和力最高的短肽，血管紧张素转化酶II（ACE2）受体保护短肽的氨基酸顺序及其赖氨基酸和C-16脂肪酸修饰后在预防和治疗新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染的应用，同时，从分子、细胞及动物水平检测了这些融合的短肽能高效和特异性靶向阻断SARS-CoV-2-S蛋白RBD与ACE2受体相互作用，最终，以鼻内给药方式予ACE2保护性短肽阻止了病毒侵入靶细胞，合成短肽为：/nC6KACE2-GZ1： KKKKKK[C-16]DKFNHEADELFY/nCACE2-GZ14： DK[C-16]FNHEADELFYMYPLQEIQNLTVGKGDFR/nCACE2-GZ8： DK[C-16]FNHEADELFY/nCACE2-GZ13： DK[C-16]FNHEADELFYMYPLQEIQNLTV/nC6KACE2-GZ7: KKKKKK[C-16]DKFNHEADELFYMYPLQEIQNLTVGKGDFR/nCACE2-GZ10： GK[C-16]GDFR/nC6KACE2-GZ3： KKKKKK[C-16]GKGDFR/nC6KRBD-GZ28 KKKKKK[C-16]VEGFNCYFPLQS/n(KKKKKK[Pal]VEGFNCYFPLQS)/nC6KRBD-GZ26 KKKKKKYK[C-16]YRYLRHGKLR (KKKKKKYK[Pal]YRYLRHGKLR)/nC6KRBD-GZ5 [C-16-]KKKKKKYLYRLF ([Pal]KKKKKKYLYRLF)/n进一步，通过不同蛋白和/或脂肪酸修饰短肽，获得SARS-CoV-2不同阻断强度候选库，并在体外模型中测试不同修饰短肽对SARS-CoV-2的阻断效果；/n进一步，采用人源ACE2受体（hACE2）转基因小鼠模型，在体内模型中测试不同修饰的短肽对SARS-CoV-2的阻断作用；/n进一步，分子水平研究C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26、C6KRBD-GZ28和C6K（对照）合成短肽在无细胞系统中是否能抑制重组SARS-CoV-2-S 蛋白RBD与ACE2受体结合；/n进一步，在无细胞系统中首先确认重组SARS-CoV-2-S 蛋白RBD与人ACE2受体的结合情况重组SARS-CoV-2-S 蛋白（nS蛋白），将其与人重组ACE2受体蛋白于37℃孵育0.5-4小时，然后与鼠或兔抗人ACE2抗体在4℃进行免疫沉淀孵育5-15小时，通过WB检测nS蛋白与ACE2受体结合情况。/n...

【技术特征摘要】
1.ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，包括对所有合成并且修饰的短肽进行计算机模拟短肽-ACE2受体蛋白结合对接分析，以筛选出与人ACE2受体蛋白亲和力最高的短肽，血管紧张素转化酶II（ACE2）受体保护短肽的氨基酸顺序及其赖氨基酸和C-16脂肪酸修饰后在预防和治疗新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染的应用，同时，从分子、细胞及动物水平检测了这些融合的短肽能高效和特异性靶向阻断SARS-CoV-2-S蛋白RBD与ACE2受体相互作用，最终，以鼻内给药方式予ACE2保护性短肽阻止了病毒侵入靶细胞，合成短肽为：
C6KACE2-GZ1：KKKKKK[C-16]DKFNHEADELFY
CACE2-GZ14：DK[C-16]FNHEADELFYMYPLQEIQNLTVGKGDFR
CACE2-GZ8：DK[C-16]FNHEADELFY
CACE2-GZ13：DK[C-16]FNHEADELFYMYPLQEIQNLTV
C6KACE2-GZ7:KKKKKK[C-16]DKFNHEADELFYMYPLQEIQNLTVGKGDFR
CACE2-GZ10：GK[C-16]GDFR
C6KACE2-GZ3：KKKKKK[C-16]GKGDFR
C6KRBD-GZ28KKKKKK[C-16]VEGFNCYFPLQS
(KKKKKK[Pal]VEGFNCYFPLQS)
C6KRBD-GZ26KKKKKKYK[C-16]YRYLRHGKLR(KKKKKKYK[Pal]YRYLRHGKLR)
C6KRBD-GZ5[C-16-]KKKKKKYLYRLF([Pal]KKKKKKYLYRLF)
进一步，通过不同蛋白和/或脂肪酸修饰短肽，获得SARS-CoV-2不同阻断强度候选库，并在体外模型中测试不同修饰短肽对SARS-CoV-2的阻断效果；
进一步，采用人源ACE2受体（hACE2）转基因小鼠模型，在体内模型中测试不同修饰的短肽对SARS-CoV-2的阻断作用；
进一步，分子水平研究C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26、C6KRBD-GZ28和C6K（对照）合成短肽在无细胞系统中是否能抑制重组SARS-CoV-2-S蛋白RBD与ACE2受体结合；
进一步，在无细胞系统中首先确认重组SARS-CoV-2-S蛋白RBD与人ACE2受体的结合情况重组SARS-CoV-2-S蛋白（nS蛋白），将其与人重组ACE2受体蛋白于37℃孵育0.5-4小时，然后与鼠或兔抗人ACE2抗体在4℃进行免疫沉淀孵育5-15小时，通过WB检测nS蛋白与ACE2受体结合情况。


2.根据权利要求1所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，其特征是：所述的无细胞系统中确认C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26和C6KRBD-GZ28合成短肽与人重组ACE2受体蛋白的结合情况将合成的短肽（包括对照C6K短肽）分别与人ACE2受体蛋白于37℃孵育0.5-2.5小时，然后与鼠或兔抗人ACE2抗体在4℃进行免疫沉淀孵育5-15小时，通过WB检测每一种合成短肽和ACE2受体结合情况。


3.根据权利要求1或2所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，其特征是：所述的无细胞系统中进一步确认C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26和C6KRBD-GZ28合成短肽分别竞争性抑制重组SARS-CoV-2-S蛋白RBD与ACE2受体结合情况在浓度均为100nM的合成短肽和重组nS蛋白情况下，将每一种合成短肽（包括C6K对照短肽）分别与重组nS蛋白和人ACE2受体同时在37℃孵育0.5-1.5小时，然后与鼠或兔抗人ACE2抗体在4℃进行免疫沉淀孵育5-15小时，通过WB检测每一种短肽和ACE2受体蛋白结合情况。


4.根据权利要求1所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，其特征是：所述的细胞的功能水平研究C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26、C6KRBD-GZ28和C6K合成短肽在II型人肺泡上皮（AT2）细胞中是否能阻止重组SARS-CoV-2-S蛋白RBD与ACE2受体蛋白结合，以及减轻或阻断其诱导的与SARS-CoV-2感染及复制相关基因表达水平。


5.根据权利要求1所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，其特征是：所述的合成短肽通过ELISA检测在AT2细胞中竞争性抑制重组SARS-CoV-2-S蛋白RBD与ACE2受体结合情况，在正常生理情况下，ACE2催化并灭活血管紧张素II，并产生血管扩张肽血管紧张素1-7(Ang1-7)，按照细胞株公司提供的培养条件，在24孔板（5X106/孔）中培养AT2细胞，分别加入每种合成短肽、ACE2蛋白受体抑制剂DX600和ACE2蛋白受体激活剂黄酮孵育0.5-3小时后，置于不同浓度的重组nS蛋白下处理1-4小时，然后分别再添加人血管紧张素II并继续培养0.5-4小时，最后，在细胞培养的上清液中，通过ELISA试剂盒检测人血管紧张素1-7含量变化。


6.根据权利要求4所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，其特征是：所述的合成短肽在AT2细胞中检测竞争性抑制重组SARS-CoV-2-S蛋白RBD诱导的与SARS-CoV-2复制及传播相关基因表达情况为SARS-CoV-2感染细胞并巧妙地进化到劫持宿主细胞以便其复制和传播，在24孔板（5X106/孔）中培养AT2细胞，分别加入每种合成短肽、ACE2受体蛋白抑制剂DX600和ACE2受体蛋白激活剂黄酮孵育0.5-3小时后，置于不同浓度的重组nS蛋白下处理1-4小时后，分别提取AT2细胞中的总RNA，通过RT-qPCR检测细胞中涉及“病毒过程的正向调节”、“病毒生命周期”、“病毒组装”以及“病毒基因组复制的正调节”的相关基因包括：SLC1A5、CXADR和CAV2等34个基因。


7.根据权利要求1所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，其特征是：所述的从动物水平检测C6KRBD-GZx合成短肽在小动物模型中是否可以防止或减轻重组SARS-CoV-2-SRBD蛋白与人ACE2受体结合以及其可能性引起的SARS-CoV-2感染样病理变化，在重组nS蛋白通过小鼠肺部给药系统肺局部给予hACE2转基因小鼠中，检测重组nSRBD与人ACE2受体结合及其SARS-CoV-2感染样病理变化，将三或四月龄大的hACE2转基因小鼠及其推荐的对照小鼠，测试三组剂量的重组nS蛋白有效结合人ACE2受体蛋白的最小剂量：10µLPBS的50(最小)、100（中度）和200µg/kg(最大)，以1.5、3和6µg重组nS蛋白/小鼠，在对照小鼠和hACE2转基因小鼠肺局部给与不同剂量的重组nS蛋白或PBS后6和18小时处死，尸检...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭骏，訾聃，李崧，谢非非，陈江，
申请(专利权)人：谭骏，
类型：发明
国别省市：贵州;52