一种11-脱氢血栓烷素B2衍生物及其制备方法与11-脱氢血栓烷素B2检测试剂技术

本发明专利技术公开了一种用于人体生物样本中11‑脱氢血栓烷素B2含量检测的11‑脱氢血栓烷素B2衍生物及其制备方法。使用该11‑脱氢血栓烷素B2衍生物获得了3种高免疫原性的11‑脱氢血栓烷素B2免疫原与相应的3种抗11‑脱氢血栓烷素B2特异性抗体以及11‑脱氢血栓烷素B2葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶标记偶联物、11‑脱氢血栓烷素B2辣根过氧化物酶标记偶联物、11‑脱氢血栓烷素B2‑多聚赖氨酸偶联物、抗11‑脱氢血栓烷素B2特异性抗体3包被的胶乳颗粒等核心组份，并制备出了3种灵敏度高、特异性强、检测效果好的11‑脱氢血栓烷素B2免疫学检验试剂。本发明专利技术还提供了3种11‑脱氢血栓烷素B2免疫检验试剂的制备方法及相应的使用方法。本发明专利技术提供的3种11‑脱氢血栓烷素B2免疫检测方法操作方便、检测快速、结果准确、灵敏度高、特异性强，能够对人体血液样本中的11‑脱氢血栓烷素B2含量进行定量检测。克服了现有技术中11‑脱氢血栓烷素B2检测方法存在的操作复杂、自动化程度低等缺陷，能有效指导临床个体化合理用药。

【技术实现步骤摘要】
一种11-脱氢血栓烷素B2衍生物及其制备方法与11-脱氢血栓烷素B2检测试剂
本专利技术属于生物
，具体涉及一种11-脱氢血栓烷素B2衍生物及其制备方法与11-脱氢血栓烷素B2检测试剂。
技术介绍
11-脱氢血栓烷素B2（11-dehydro-thromboxaneB2，11dhTXB2）的化学结构式如下述式（Ⅳ）所示：式（Ⅳ）。11-脱氢血栓烷素B2是血栓烷素A2（thromboxaneA2，TXA2）的终末代谢产物，主要经肾脏代谢。TXA2则是花生四烯酸在环氧合酶（cyclooxygenase，COX）作用下产生的具有促血小板聚集、收缩血管等生物活性作用的物质，在血栓形成过程中有重要作用。阿司匹林能通过不可逆地抑制COX-1活性，减少TXA2合成，从而抑制血小板聚集及其在冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）发展和急性冠状动脉综合征（acutecoronarysyndrome，ACS）发生中的作用。TXA2的代谢产物11dhTXB2水平能反映血小板活性及阿司匹林的抗血小板效果。阿司匹林能通过抑制血小板COX-1活性有效抑制血小板功能，从而降低心血管事件风险。尿11dhTXB2浓度反映血栓烷素的整体合成水平，因而能直接反映阿司匹林对血栓烷素合成及对血小板功能的抑制效果。研究表明：冠心病危险人群及冠心病患者（尤其是ACS患者）基础（未应用阿司匹林时）尿11dhTXB2水平明显高于健康人群，且与危险因素水平有正相关趋势，提示血小板活性逐渐增加；性别、年龄、体重等因素也对血栓烷素代谢有一定影响；应用阿司匹林能显著降低所有人群的尿11dhTXB2水平，抑制率为60%~80%；高危人群及冠心病患者应用阿司匹林后的尿11dhTXB2水平亦明显高于健康人群，提示有更高的HAPR发生率及心血管不良事件发生风险；多数预后研究支持应用阿司匹林后尿11dhTXB2高水平所提示的HAPR与心血管事件发生率增加有关。减少尿11dhTXB2排泌的措施可改善阿司匹林反应，或可降低心血管不良事件风险。目前11dhTXB2的检测方法包括放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）、酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）及液相色谱-串联质谱法（liquidchromatography-tandemmassspectrometry，LC-MS/MS）。RIA法由于存在放射性污染问题已逐渐被淘汰；由于11dhTXB2的分子量较小，且在尿液中的浓度不高，目前多采用ELISA法进行测定，所使用的抗11dhTXB2抗体有单克隆抗体和多克隆抗体两种，测得的尿11dhTXB2浓度需用尿肌酸酐浓度进行校正，以排除尿液浓度和肾功能的影响，因此可用随机尿样本进行检测。但是ELISA法只能获得半定量的检测结果，无法进行精确定量。LC-MS/MS法应用时间较短，但能较为特异地检测11dhTXB2，检测结果变异率也较小，但是该方法操作复杂、检测速度较慢、且需要特殊仪器，成本较高。因此，研发一种高通量、快速化、无污染、高灵敏度、高特异性、结果精确、操作简便、成本低廉的11-脱氢血栓烷素B2检测方法具有重要意义。本专利技术利用新型11-脱氢血栓烷素B2衍生物研制的抗11-脱氢血栓烷素B2特异性系列抗体可以用于制备多种灵敏度高、特异性强、检测效果好的11-脱氢血栓烷素B2免疫检验试剂，能有效弥补传统方法的缺点。本专利技术的3种11-脱氢血栓烷素B2检测试剂，可以对11-脱氢血栓烷素B2的含量进行精确定量检测，与RIA、ELISA、LC-MS/MS等传统方法相比，本专利技术提供的免疫检测方法具有操作简便、检测快速、结果准确、费用低廉、安全环保等优势，有利于将来临床大规模推广应用，特别是对于缺乏昂贵仪器的基层医院具有良好的应用前景。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术所采用的技术方案是：一、提供一种11-脱氢血栓烷素B2衍生物，该衍生物为新合成物质，自然界中不存在，其结构式如式Ⅰ所示：式Ⅰ。二、提供一种如上所述的11-脱氢血栓烷素B2衍生物的合成方法，该合成方法有别于常规合成方法，并具有良好的合成效果，显著提高11-脱氢血栓烷素B2衍生物的合成效率，具体合成路线如下所示：。将100mg化合物1溶解于2mL的二甲基甲酰胺中，然后在0℃条件下加入0.1g化合物2、0.6g三乙胺以及0.12g2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，制成反应混合溶液，将此反应混合溶液在室温下搅拌过夜，反应结束后将固体物质过滤除去，并将滤液浓缩，最后将浓缩所得的剩余物通过快速柱层析法纯化，得到11-脱氢血栓烷素B2衍生物。三、提供一种11-脱氢血栓烷素B2均相酶免疫检测试剂，该检测试剂由R1试剂与R2试剂组成，所述R1试剂包含抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体1与R1缓冲液，所述R2试剂包含11-脱氢血栓烷素B2葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物与R2缓冲液；所述抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体1为11-脱氢血栓烷素B2人血清白蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体；所述的11-脱氢血栓烷素B2人血清白蛋白免疫原，由上述的11-脱氢血栓烷素B2衍生物与人血清白蛋白偶联而成，其结构式如式Ⅱ所示：式Ⅱ；所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种；所述的R1缓冲液含有酶底物、辅酶、牛血清白蛋白及Tris缓冲液，所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸，所述的辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型；所述的11-脱氢血栓烷素B2葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物由上述的11-脱氢血栓烷素B2衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）偶联而成；其结构式如式Ⅲ所示：式Ⅲ；所述的R2缓冲液为含有牛血清白蛋白的Tris缓冲液。四、提供一种如上所述的11-脱氢血栓烷素B2均相酶免疫检测试剂的制备方法，包含以下步骤：（1）将0.25%牛血清白蛋白、50mmol/L葡萄糖-6-磷酸及50mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型依次加入50mmol/LTris缓冲液中搅拌溶解制成R1缓冲液，再将抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体1以1∶500-1∶5000的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀，再用6mol/L的盐酸调节pH至8.0，制成R1试剂；（2）将0.25%牛血清白蛋白加入100mmol/LTris缓冲液中搅拌溶解制成R2缓冲液，再将11-脱氢血栓烷素B2葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶1000-1∶8000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀，再用6mol/L的盐酸调节pH至7.6，制成R2试剂；所述抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体1的制备方法，包含以下步骤：a.将11-脱氢血栓烷素B2人血清白蛋白免疫原用PBS缓冲液稀释至2.0-5.0mg/ml，得到抗原溶液，然后将2.0-5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；b.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种11-脱氢血栓烷素B2衍生物，其特征在于，其结构式如式Ⅰ所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种11-脱氢血栓烷素B2衍生物，其特征在于，其结构式如式Ⅰ所示：



式Ⅰ。


2.一种如权利要求1所述的11-脱氢血栓烷素B2衍生物的合成方法，其特征在于，所述合成方法的具体路线如下所示：

；
将100mg化合物1溶解于2mL的二甲基甲酰胺中，然后在0℃条件下加入0.1g化合物2、0.6g三乙胺以及0.12g2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，制成反应混合溶液，将此反应混合溶液在室温下搅拌过夜，反应结束后将固体物质过滤除去，并将滤液浓缩，最后将浓缩所得的剩余物通过快速柱层析法纯化，得到11-脱氢血栓烷素B2衍生物。


3.一种11-脱氢血栓烷素B2均相酶免疫检测试剂，其特征在于，由R1试剂与R2试剂组成，所述R1试剂包含抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体1与R1缓冲液，所述R2试剂包含11-脱氢血栓烷素B2葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物与R2缓冲液；所述抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体1为11-脱氢血栓烷素B2人血清白蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体；所述的11-脱氢血栓烷素B2人血清白蛋白免疫原，由权利要求1所述的11-脱氢血栓烷素B2衍生物与人血清白蛋白偶联而成，其结构式如式Ⅱ所示：



式Ⅱ；
所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种；
所述的R1缓冲液含有酶底物、辅酶、牛血清白蛋白及Tris缓冲液，所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸，所述的辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型；
所述的11-脱氢血栓烷素B2葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物由权利要求1所述的11-脱氢血栓烷素B2衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联而成；其结构式如式Ⅲ所示：



式Ⅲ；
所述的R2缓冲液为含有牛血清白蛋白的Tris缓冲液。


4.一种如权利要求3所述的11-脱氢血栓烷素B2均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包含以下步骤：
（1）将0.25%牛血清白蛋白、50mmol/L葡萄糖-6-磷酸及50mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型依次加入50mmol/LTris缓冲液中搅拌溶解制成R1缓冲液，再将抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体1以1∶500-1∶5000的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀，再用6mol/L的盐酸调节pH至8.0，制成R1试剂；
（2）将0.25%牛血清白蛋白加入100mmol/LTris缓冲液中搅拌溶解制成R2缓冲液，再将11-脱氢血栓烷素B2葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶1000-1∶8000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀，再用6mol/L的盐酸调节pH至7.6，制成R2试剂；
所述抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体1的制备方法，包含以下步骤：
a.将11-脱氢血栓烷素B2人血清白蛋白免疫原用PBS缓冲液稀释至2.0-5.0mg/ml，得到抗原溶液，然后将2.0-5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；
b.1-4周后，再用2.0-5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔1-4周注射一次，共计注射3-8次；
c.对免疫后的实验动物取血，分离纯化抗血清，得到抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体1；
所述的11-脱氢血栓烷素B2人血清白蛋白免疫原的制备方法，包含以下步骤：
a.称取2.0-5.0g磷酸二氢钾、3.0-6.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-2.5g氯化镁，共同溶解于1.0-2.5L去离子水中，调节pH至7.8-8.3，制成缓冲溶液A；
b.称取3.0-6.0mg人血清白蛋白，0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液A中，制成人血清白蛋白载体溶液；
c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的11-脱氢血栓烷素B2衍生物，0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液A中，再加入0.2-0.5ml二甲基甲酰胺，制成11-脱氢血栓烷素B2衍生物溶液A；
d.当上述11-脱氢血栓烷素B2衍生物溶液A刚变澄清时，将其逐滴加入上述人血清白蛋白载体溶液中，然后将此混合溶液在-18～-2℃下搅拌3-10小时；
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液A进行透析，透析后所得溶液即为11-脱氢血栓烷素B2人血清白蛋白免疫原溶液，在11-脱氢血栓烷素B2人血清白蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20%的叠氮钠防腐剂，于-20℃下储存；
所述的11-脱氢血栓烷素B2葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法，包含以下步骤：
a.称取1.0-3.0g磷酸二氢钾、1.0-5.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-3.0g氯化镁，共同溶解于1.0-2.5L去离子水中，调节pH至7.8-8.3，制成缓冲溶液B；
b.称取3.0-6.0mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、2.0-5.0mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1.5-3.5mg葡萄糖-6-磷酸，0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液B中，再加入1.0-2.0ml二甲基亚砜，制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的11-脱氢血栓烷素B2衍生物，0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液B中，再加入200-500µl二甲基甲酰胺，制成11-脱氢血栓烷素B2衍生物溶液B；
d.当上述11-脱氢血栓烷素B2衍生物溶液B刚变澄清时，将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，然后将此混合溶液在-18～-2℃下搅拌3-10小时；
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液B作为洗脱液通过G-25凝胶层析柱进行纯化，纯化后所得溶液即为11-脱氢血栓烷素B2葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物溶液，在11-脱氢血栓烷素B2葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物溶液中加入质量分数0.5-1.0%的BSA和质量分数0.05-0.20%的叠氮钠防腐剂，于0～8℃下储存。


5.一种如权利要求3所述的11-脱氢血栓烷素B2均相酶免疫检测试剂的使用方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
（1）在全自动生化分析仪中加入校准品、R1试剂，混匀，37℃温育3-5分钟；加入R2试剂，混匀，37℃恒温5-10分钟后，340nm主波长/405nm次波长进行检测，连续监测3分钟内的吸光度变化率，由全自动生化分析仪制作校准曲线；
（2）在全自动生化分析仪中加入待测样本、R1试剂，混匀，37℃温育3-5分钟；加入R2试剂，混匀，37℃恒温5-10分钟后，340nm主波长/405nm次波长进行检测，连续监测3分钟内的吸光度变化率，由全自动生化分析仪根据步骤（一）中制作的校准曲线自动计算待测样本中11-脱氢血栓烷素B2的含量；
所述试剂R1与试剂R2按1:1～4:1的体积比使用；所述的待测样本为血清、血浆、尿液、唾液、组织液或脑脊液中的任意一种。


6.一种11-脱氢血栓烷素B2的ELISA检测试剂，其特征在于，该检测试剂含有：抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体2、11-脱氢血栓烷素B2辣根过氧化物酶标记偶联物及反应底物；
所述抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体2为11-脱氢血栓烷素B2人甲状腺球蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体；所述的11-脱氢血栓烷素B2人甲状腺球蛋白免疫原，由权利要求1所述的11-脱氢血栓烷素B2衍生物与人甲状腺球蛋白偶联而成，其结构式如式Ⅳ所示：



式Ⅳ；
所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种；
所述的11-脱氢血栓烷素B2辣根过氧化物酶标记偶联物由权利要求1所述的11-脱氢血栓烷素B2衍生物与辣根过氧化物酶偶联而成；其结构式如式Ⅴ所示：



式Ⅴ；
所述的反应底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺；
所述抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体2的制备方法，包含以下步骤：
a.将11-脱氢血栓烷素B2人甲状腺球蛋白免疫原用PBS缓冲液稀释至2.0-5.0mg/ml，得到抗原溶液，然后将2.0-5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；
b.1-4周后，再用2.0-5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔1-4周注射一次，共计注射3-8次；
c.对免疫后的实验动物取血，分离纯化抗血清，得到抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体2；
所述的11-脱氢血栓烷素B2人甲状腺球蛋白免疫原的制备方法，包含以下步骤：
a.称取2.0-5.0g磷酸二氢钾、3.0-6.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-2.5g氯化镁，共同溶解于1.0-2.5L去离子水中，调节pH至7.8-8.3，制成缓冲溶液C；
b.称取3.0-6.0mg人甲状腺球蛋白，0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液C中，制成人甲状腺球蛋白载体溶液；
c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的11-脱氢血栓烷素B2衍生物，0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液C中，再加入0.2-0.5ml二甲基甲酰胺，制成11-脱氢血栓烷素B2衍生物溶液C；
d.当上述11-脱氢血栓烷素B2衍生物溶液C刚变澄清时，将其逐滴加入上述人甲状腺球蛋白载体溶液中，然后将此混合溶液在-18～-2℃下搅拌3-10小时；
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液C进行透析，透析后所得溶液即为11-脱氢血栓烷素B2人甲状腺球蛋白免疫原溶液，在11-脱氢血栓烷素B2人甲状腺球蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20%的叠氮钠防腐剂，于-20℃下储存；
所述的11-脱氢血栓烷素B2辣根过氧化物酶标记偶联物的制备方法，包含以下步骤：
a.称取1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小可，朱嵘，陈文杰，成志鹏，王永霞，
申请(专利权)人：湖南苏阳医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43