mRNA疫苗及其合成方法、试剂盒技术

本发明专利技术公开一种mRNA疫苗及其合成方法、试剂盒，所述mRNA疫苗由：三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列，和/或，跨膜蛋白‑包膜E的表位抗原基因序列，和/或，膜糖蛋白M的表位抗原基因序列，和/或，核衣壳N的表位抗原基因序列，和/或，三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列制备得到。本发明专利技术技术方案通过基因工程的方法设计mRNA疫苗，以实现对新型冠状病毒的免疫。

【技术实现步骤摘要】
mRNA疫苗及其合成方法、试剂盒本申请要求2020年02月06日申请的，申请号为202010083614.6，专利技术名称为“mRNA疫苗及其合成方法、试剂盒”中国专利申请的优先权。
本专利技术涉及生物制药
，特别涉及一种mRNA疫苗及其合成方法、试剂盒。
技术介绍
冠状病毒(Coronavirus)是自然界广泛存在的一类RNA病毒，因该病毒形态在电镜下观察类似王冠而得名。冠状病毒是一个成员众多的大家族，仅感染脊椎动物，可引起人和动物呼吸道、消化道和神经系统疾病。新型冠状病毒(2019-nCoV)呈现球形椭球形，直径在80-120nm。在电子显微镜下，病毒粒表面有球棒状的突出部分，由三聚体刺突糖蛋白(Spike，S)组成。病毒的包膜由膜糖蛋白(membraneglycoprotein，M)构成，通过三个跨膜结构域嵌入病毒包膜里中。此外，少量的小的跨膜蛋白-包膜(envelope，E)蛋白也出现在包膜中。最后，核衣壳(nucleocapsid，N)蛋白以串珠的形式结合到RNA基因组上，形成螺旋对称的核衣壳。研究结果显示，S、M、E和N蛋白是冠状病毒引起机体免疫反应的主要成分。此外，S蛋白中的受体结合域(receptorbindingdomain,RBD)通过与人的ACE2蛋白相互作用从而感染人的呼吸道上皮细胞。mRNA疫苗在安全性、快速制备和免疫原性方面具有颠覆性的优势。传统的灭活疫苗、减毒疫苗以及多肽疫苗，研发周期长、生产工艺复杂，通常生产一种传统流感疫苗至少需要5-6个月的时间；但是mRNA疫苗可以实现标准化生产，从抗原序列设计到生产只需要6周时间。且mRNA疫苗不存在减毒疫苗潜在的逆转危险；不存在灭活疫苗的恢复突变问题。在免疫原性上，mRNA疫苗能够诱导B细胞和T细胞免疫应答，能引起免疫记忆效果，传递更多有效抗原，并且能一次表达多个抗原。此外，与DNA疫苗相比，mRNA疫苗有着明显优势：首先，mRNA疫苗比DNA疫苗药效更加明显，具体表现为DNA疫苗需要穿过细胞膜和核膜才能表达成抗原，当没有足够剂量的DNA到达细胞核时，疫苗将无法激活体内免疫系统以及诱导抗体的产生；而mRNA只需要穿过细胞膜在细胞质中就可以高效表达抗原蛋白。其次，mRNA疫苗比DNA疫苗生物安全性更高，具体地，外源DNA有一定几率整合到人体基因组中，因此DNA疫苗有引起基因组突变的风险；而mRNA没有基因整合到基因组中的风险。再次，mRNA被翻译成蛋白质后易被降解，其瞬时表达的特性不仅确保了mRNA药物的安全性，而且使其剂量可控，避免了疫苗药物长期暴露引起的抗原免疫耐受(对特定抗原无反应的状态)。并且，由于不需要动物来源的病毒参与到疫苗研发过程中，规避了病毒和动物使用风险，同时可以短期内获得有效抗原。相关技术中，未发现能应对新型冠状病毒(2019-nCoV)的mRNA疫苗。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种mRNA疫苗，旨在至少解决上述出现的至少一个技术问题。为实现上述目的，本专利技术提出一种mRNA疫苗，所述mRNA疫苗由：三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列，和/或跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列，和/或膜糖蛋白M的表位抗原基因序列，和/或核衣壳N的表位抗原基因序列，和/或三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列制备得到，其中，三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列选自SEQID：1或2，跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列选自SEQID：3或4，膜糖蛋白M的表位抗原基因序列选自SEQID：5或6，核衣壳N的表位抗原基因序列选自SEQID：7或8，三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列选自SEQID：9或10。具体地，所述SEQID：1～10的DNA序列如下列表1所示。表1可选地，所述mRNA疫苗由跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列、膜糖蛋白M的表位抗原基因序列和核衣壳N的表位抗原基因序列制备得到。可选地，所述mRNA疫苗由三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列、膜糖蛋白M的表位抗原基因序列、跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列和核衣壳N的表位抗原基因序列制备得到。可选地，所述mRNA疫苗由三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列、膜糖蛋白M的表位抗原基因序列、跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列、核衣壳N的表位抗原基因序列和三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列制备得到。可选地，所述表位抗原基因序列之间由连接肽隔开。本专利技术还提供一种规模化合成mRNA疫苗的方法，该方法包括：a、根据新型冠状病毒的基因组测序结果，设计并人源化三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列，和/或跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列，和/或膜糖蛋白M的表位抗原基因序列，和/或核衣壳N的表位抗原基因序列，和/或三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列；b、根据步骤a中人源化后的表位抗原基因序列合成编码三聚体刺突糖蛋白S，和/或跨膜蛋白-包膜E，和/或膜糖蛋白M，和/或核衣壳N，和/或三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的DNA片段，并将所述DNA片段连接到DNA载体上，酶切后进行体外转录，以获得如上所述的mRNA疫苗；c、将步骤b中获得的mRNA疫苗进行纯化，所纯化方法包括氯化锂/乙醇沉淀、离心柱、氯萃取/乙醇沉淀、凝胶纯化或高效液相色谱纯化中的一种或其组合，以获得纯化后的mRNA疫苗。可选地，所述步骤b中将所述DNA片段连接到DNA载体上，酶切后进行体外转录，以获得mRNA疫苗的步骤具体包括：将所述DNA片段连接到pcDNA3.3载体上，酶切后进行体外转录，得到未加帽的mRNA，然后向所述未加帽的mRNA中加入加帽酶，给未加帽的mRNA的5'端加上帽子结构，以获得具有帽子1结构和帽子2结构的常规mRNA疫苗，和/或加入抗反向帽类似物ARCA进行体外共转录，得到具有帽子0结构的常规mRNA疫苗；或，将所述DNA片段连接到pcDNA3.3-nsPs载体上，酶切后进行体外转录，得到未加帽的mRNA，然后向所述未加帽的mRNA中加入加帽酶，给未加帽的mRNA的5'端加上帽子结构，以获得具有帽子1结构和帽子2结构的能实现自我复制的长效mRNA疫苗，和/或加入抗反向帽类似物ARCA进行体外共转录，得到具有帽子0结构的能实现自我复制的长效mRNA疫苗。可选地，所述加帽酶包括RNA三磷酸酶、RNA谷氨酸转移酶、鸟嘌呤-7-甲基转移酶或二氧基甲基化转移酶中的一种或其组合。可选地，所述帽子结构为帽子1结构和帽子2结构中的一种或其组合。本专利技术还提供了一种试剂盒，包括如上所述的mRNA疫苗。本专利技术技术方案通过基因工程的方法设计并优化新型冠状病毒2019-nCoV中具有免疫源性的三聚体刺突糖蛋白S、跨膜蛋白-包膜E、膜糖蛋白M、核衣本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗由：/n三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列，和/或/n跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列，和/或/n膜糖蛋白M的表位抗原基因序列，和/或/n核衣壳N的表位抗原基因序列，和/或/n三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列制备得到，/n其中，三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列选自SEQ ID：1或2，跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列选自SEQ ID：3或4，膜糖蛋白M的表位抗原基因序列选自SEQ ID：5或6，核衣壳N的表位抗原基因序列选自SEQ ID：7或8，三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列选自SEQ ID：9或10。/n

【技术特征摘要】
20200206 CN 20201008361461.一种mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗由：
三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列，和/或
跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列，和/或
膜糖蛋白M的表位抗原基因序列，和/或
核衣壳N的表位抗原基因序列，和/或
三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列制备得到，
其中，三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列选自SEQID：1或2，跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列选自SEQID：3或4，膜糖蛋白M的表位抗原基因序列选自SEQID：5或6，核衣壳N的表位抗原基因序列选自SEQID：7或8，三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列选自SEQID：9或10。


2.如权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗由跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列、膜糖蛋白M的表位抗原基因序列和核衣壳N的表位抗原基因序列制备得到。


3.如权利要求2所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗由三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列、跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序、膜糖蛋白M的表位抗原基因序列列和核衣壳N的表位抗原基因序列制备得到。


4.如权利要求3所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗由三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列、跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列、膜糖蛋白M的表位抗原基因序列、核衣壳N的表位抗原基因序列和三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列制备得到。


5.如权利要求2-4任一项所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述表位抗原基因序列之间由连接肽隔开。


6.一种规模化合成mRNA疫苗的方法，其特征在于，该方法包括：
a、根据新型冠状病毒的基因组测序结果，设计并人源化三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列，和/或
跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列，和/或
膜糖蛋白M的表位抗原基因序列，和/或
核衣壳N的表位抗原基因序列，和/或

【专利技术属性】
技术研发人员：张苗苗，
申请(专利权)人：深圳市瑞吉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44