【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及治疗或预防获得性免疫缺乏症(AIDS)或爱滋前症(也称作爱滋相关综合症即ARC)的疫苗，包括胸腺素α1肽片段及其类似物或HTLV-Ⅲ，LAV，ARV-2的p 17gag核心蛋白的肽片段或其它类似逆转病毒的新抗体和抗血清。本专利技术还涉及一种诊断试验，用于直接检测HTLV-Ⅲ，LAV，ARV-2等逆转病毒在血液中地存在。 获得性免疫缺乏症(AIDS)是一种疾病，其特征在于助T-细胞(T+4)和淋巴细胞比值(T+4/T+8)的降低和机会致病菌感染和免疫系统进行性瘫痪的发病率的增加。爱滋病的病因已经被鉴别为人的T-亲淋巴性逆转病毒HTLV-Ⅲ(称作LAV或ARV)。在很多方面，爱滋病的临床症状不能区别于少有的儿童先天免疫缺乏症中常见的症状，后者表现为胸腺发育不全或再生不良并且增加机会致病菌感染的敏感性，包括卡氏肺囊虫肺炎。在淋巴系统的成熟及发挥功能方面起关键作用的胸腺可能与爱滋病有关，这一点已经由于在得爱滋病的个人或属于爱滋病危险群的血液中检测到增高的Tα1类肽水平而得到隐含说明。见Naylor，P.H.等人所著NYASMONOGRAPH ON ALDS，437，88(1985);Hirsh，E.M.等New Eng.J.Med.，308，45(1983);Biggar，R.J.等New Eng.J.Med.，309，49(1983)Kreiss，J.K.等Annal Int.Med，100，178(1984);Kessler，C.M.等Brit.J.Hematology，58，325(1984)。 Tα1是第一个纯化成均匀的并从部分纯化...
【技术保护点】
具有下式（Ｉ）的胸腺素χ１肽片段或其类似物，Ａ↓［ｏ］－Ｉｌｅ－Ｘ↓［１］－Ｘ↓［２］－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ｘ↓［３］－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｘ↓［４］－Ｘ↓［５］－Ｘ↓［６］－Ｘ↓［７］－Ｘ↓［８］－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｘ↓［９］－Ｘ↓［１０］－Ａ ｓｎ.ＣＯＯＨ（Ｉ）其中Ｘ↓［１］－Ｘ↓［１０］各自为一个氨基酸，Ａ↓［０］是ＮＨ↓［２］或１至约６个氨基酸的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
US 1986-5-19 864599中集体称作爱滋(AIDS)-病毒。 起初由于在爱滋(AIDS)患者中观察到胸腺素α(Tα)的水平增高，因而发现在胸腺素α1的18-氨基酸序列与HTLV-Ⅲ和ARV病毒间有高度的(50%)间源性。胸腺素α1有以下氨基酸序列 Ac-丝氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-丙氨酸-缬氨酸- 天冬氨酸-苏氨酸-丝氨酸-丝氨酸-谷氨酸- 异亮氨酸-苏氨酸-苏氨酸-赖氨酸-天冬氨酸- 亮氨酸-赖氨酸-谷氨酸-赖氨酸-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-缬氨酸-谷氨酸-谷氨酸- 丙氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-COOH HTLV-Ⅲ/LAV和ARV-2的gag基因蛋白，含有512氨基酸的4gag蛋白，gag p17，gag p24，gag p7和gag p9，其相应的分子量约为17000，24000，7，000和9，000。胸腺素α1的初级序列和p17蛋白的比较表明在胸腺素α1的11和28位以及gag蛋白的92和109位之间的18氨基酸区有44%至50%的同源性，如下所示 胸腺素α1ARV-2核心蛋白 HTLV-Ⅲ/LAV 核心蛋白 1 1′ 1″ 11 异亮氨酸 92′ 异亮氨酸 92′ 异亮氨酸 苏氨酸 天冬氨酸 谷氨酸 苏氨酸 缬氨酸 异亮氨酸 14 赖氨酸 95 赖氨酸 95 赖氨酸 15 天冬氨酸 96 天冬氨酸 96 天冬氨酸 亮氨酸 苏氨酸 苏氨酸 17 赖氨酸 98 赖氨酸 98 赖氨酸 18 谷氨酸 99 谷氨酸 99 谷氨酸 赖氨酸 丙氨酸 丙氨酸 赖氨酸 亮氨酸 亮氨酸 21 谷氨酸 102 谷氨酸 天冬氨酸 缬氨酸 赖氨酸 赖氨酸 缬氨酸 异亮氨酸 异亮氨酸 胸腺素α ARV-2核心蛋白 HTLV-Ⅲ/LAV 核心蛋白 1 1′ 1″ 24 谷氨酸 105 谷氨酸 105 谷氨酸 25 谷氨酸 106 谷氨酸 106 谷氨酸 丙氨酸 谷氨酸 谷氨酸 谷氨酸 谷氨酰胺 谷氨酰胺 28 天冬酰胺 109 天冬酰胺 109 天冬酰胺 COOH 512′ COOH 512′ COOH 根据这种不寻常的高度同源性，对胸腺素α1的抗体(Ab Tα1)作了评估，通过测量其抑制HTLV-Ⅲ/LAV在H9允许细胞系内再生的能力来检测其中和爱滋病毒的能力。为了在用胸腺素α1免疫的兔子的血清中检测HTLV-Ⅲ/LAV中和抗体的存在，使用了如P.S.Sarin等人所述[Biochim.Pharmacol.，34，4075(1985)]的H9细胞中的HTLV-Ⅲ/LAV再生系统。 总之，通过测量在培养基中反应转录酶(RT)的活性并对HTLV-Ⅲ/LAV的P15和P24的表达使用间接免疫萤光检测法，可以监控H9细胞的感染。免疫萤光检测法是在固定于甲醇∶丙酮(1∶1)的细胞又作的，并且用了HTLV-Ⅲ/LAVP15和P24的单克隆抗体。经过或未经过抗体处理的HTLV-Ⅲ/LAV感染细胞固定在弓形体病载玻片上。在室温下用甲醇∶丙酮(1∶1)固定30分钟后，载玻片在-20℃下存入密封的塑料袋直至使用。单克隆抗体被加到复制池，室温下在湿室内培养1小时并用含0.25% Triton×-100的PBS缓冲液冲洗2小时。然后使细胞与结合了萤光素的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)的抗血清[Capell Labs](FITC)接触1小时。并用含0.25% Triton×-100的PBS缓冲液冲洗过夜。载玻片用50%的甘油装片，在Zeiss萤光显微镜下观察细胞的萤光。 对十组不同的在兔子上制备的Tα1异源抗血清进行的分析确定了HTLV-Ⅲ/LAV中和抗体的存在(表1)。Tα1的抗血清是按美国专利4，264，571所述的方法并结合胸腺素α的放射免疫检测来制备的。总之，合成的Tα1通过戊方醛与钥孔血蓝素(KLH)结合(1∶1重量)给出100微克/毫升的Tα1最后浓度。结合物与弗氏完全佐剂混合(1毫升与1毫升)，并给新西兰白兔在数处真皮内注射。在6周内(2至4月)以周出向隔给兔子加强注射(在弗氏完全佐剂中100微克Tα)。休息一个月后，动物每月接受加强注射直至连到最大效价。在所有情况下，RT被显著抑制(53±3%)，但所用的几种经1∶20稀释的粗制抗血清显示出某些对H9细胞的细胞毒性和/或不能抑制P15和P24的表达。相应地，选择了4组Tα1抗血清，对每一组都制备了免疫球蛋白(IgG)富集的制剂以确认抗病毒的活性自由IgG介导的。IgG富集的制剂是用硫酸铵(40%)沉淀法来制备的。在离心分离后，沉淀物溶解在PBS中并对PBS透析24小时。然后每组用0.8微米的过滤器微孔化。取代或者除了硫酸铵沉淀法外，抗血清还可用其它常规方法浓缩，例如，Staph-A提纯法，高压液相色谱(HPLC)提纯法等。 如在表2中归纳的，Tα1抗血清的浓缩IgG制剂在中和HTLV-Ⅲ/LAV方面自高度有效的;它们抑制病毒蛋白P15和P24的表达和RT的活性并且对H9细胞没有细胞毒性。Tα1免疫兔子的抗血清在中和爱滋病毒方面与那些爱滋综合症及爱滋病患者的血清同样有效，后者也表现出中和活性。这样，这种对Tα1以及HTLV-Ⅲ/LAV核心蛋白中的共同抗原决定簇的抗血清或IgG富集制剂不仅在体外中和这种病毒自高度有效的，而且与抗中和抗体相比较更出有利，上述抗体存在于从爱滋病患者身上得到的某些血清中。 表1 胸腺素α1的全抗血清对HTLV-Ⅲ/LAV的中和 ＃ 试验号 血清稀 H9细胞 控制百分比 释度 10细胞/毫升 P15 P24 RT 1.H9细胞 - 1.3 - - - (无病毒) 2.H9/HTLV-Ⅲ/LAV - 0.96 100 100 100 3.＃2+爱滋患者的血清 1∶100 1.4 25 33 13 试验 - 4.＃2+正常兔子血清 1∶20 1.21 100 100 100 5.＃2+Tα抗血清 1∶20 0.33 100 33 43 (第一组) 6.＃2+Tα抗血清 1∶20 0.33 50 33 42 (第二组) 7.＃2+Tα抗血清 1∶20 0.33 50 66 60 (第三组) 8.＃2+Tα抗血清 1∶20 0.19 25 33 45 (第四组) 9.＃2+Tα抗血清 1∶20 0.14 25 33 59 (第五组) 10.＃2+Tα抗血清 1∶20 0.29 100 133 62 (第六组) 表1(续)胸腺素α1的全抗血清对HTLV-Ⅲ/LAV的中和 ＃ 试验号 血清稀 H9细胞 控制百分比 释度 106细胞/毫升 P15 P24 RT 11.＃2+Tα抗血清 1∶20 0.71 125 166 72 (第七组) 12.＃2+Tα抗血清 1∶20 0.14 125 100 58 (第八组) 13.＃2+Tα抗血清 1∶20 0.16 50 33 50 (第九组) 14.＃2+Tα抗血清 1∶20 0.31 50 66 42 (第十组) 表1说明 ＊H9细胞的HTLV-Ⅲ/LAV感染H9细胞用polybrene(2微克/毫升)在37℃下处理30分钟，洗净polybrene并用2×108个HTLV-Ⅲ/LAV病毒颗粒对4×105个H9细胞进行感染。为了检测中和抗体，血清在56℃下热灭活30分钟，通过0.45微米过滤器过滤。适当稀释的抗体在24孔的平底板(2毫升)中与HTLV-Ⅲ/LAV相混合(500病毒颗粒/细胞)，该板在4℃下保温1小时并在20℃下保温15分钟。将H9细胞加入孔内以得到5×105细胞/毫升的最后浓度。培养基在37℃及5% CO的条件下保温96小时。这一阶段后，在存在锥虫兰的情况下对存活细胞计数。在500×g的条件下将细胞悬浮物离心10分钟。上清液作反向转录酶检测处理，细胞装在弓形体病载玻片上，在甲醇∶丙酮(1∶1)中固定量用P.S.Sarin等人在“Biochem.pharm.34，4075(1985)”中所述的方法用HTLV-Ⅲ/LAV，P15以及P24的单克隆抗体进行分析。 表2 用部分纯化的胸腺素α1的IgG抗 血清中和HTLV-Ⅲ/LAV和抑 制病毒的再生 ＃ 试验号 血清稀 H9细胞 控制 % 释度 10细胞/毫升 RT P15 P24 1.H9细胞 - 1.56 - - - (无病毒) 2.H9/HTLV-Ⅲ/LAV＊- 0.26 100 100 100 3.＃2+正常血清 1∶20 0.32 100 100 100 4.＃2+Tα抗血清 1∶20 1.00 31 18 21 (第二组＊＊) 1∶50 0.98 38 26 36 5.＃2+Tα抗血清 1∶20 1.48 46 21 15 (第五组＊＊) 1∶50 1.34 77 58 43 6.＃2+Tα抗血清 1∶20 1.26 36 15 18 (第七组＊＊) 1∶50 1.32 62 33 25 7.＃2+Tα抗血清 1∶20 1.18 42 18 18 (第九组＊＊) 1∶50 1.02 57 33 28 ＊ H9细胞H9细胞用polybrene(2微克/毫升)在37℃下处理30分钟，洗净polybrene并用2×108个HTLV-Ⅲ/LAV病毒颗粒/4×105个H9细胞予以感染。培养液在感染后的第4天进行分析。中和抗体的检测按表1所述进行。 ＊＊ Ig G富集的血清是用硫酸铵沉淀法来制备的。在沉淀前试验各批Tα1抗体的活性。 为方便起见，表2中H9细胞计数的数据绘制于图1中。从图1立即可看出抗Tα1的抗体在中和爱滋病毒方面是高度有效的。另外，从这些数据中可得出这样的结论，即病毒基因组的这个抗原决定簇区(gag蛋白的92-109位)对爱滋病毒的再生是关键性的。 相应地，本发明提供了预防和治疗爱滋病的抗血清，在一个具体实施方案中这种预防和治疗是基于服用胸腺素α1的抗体或其肽段的或胸腺素α1的类似物的抗体，包括至少在11至28位的共同表位的，或者HTLV-Ⅲ/LAV或ARV-2的P17 gag蛋白的共同抗原决定簇的抗体，包括至少从92位左右到至少109位左右(即被动免疫)。在另一个具体实施方案中(主动免疫)，这些肽中的任何一个均提供一种疫苗，当接触爱滋病毒的、有患爱滋病危险的、或受爱滋感染的个人接受这种疫苗时，这种疫苗会引起个人的免疫系统产生抗这种肽的特异性抗体并且有效地抑制爱滋病毒的再生。 由以下通式(Ⅰ) Ao-异亮氨酸-X1-X2-赖氨酸-天冬氨酸-X3- 赖氨酸-谷氨酸-X4-X5-X6-X7-X8-谷氨酸- 谷氨酸-X9-X10-天冬酰胺-COOH 表示的胸腺素α1C-端的那些肽段或其类似物，或其盐、酯醚或酰胺。 式中Ao是NH2或从1至6个左右氨基酸组成的氨基酸序列， X1-X10均是天然氨基酸，在gag蛋白的至少从约92位至约109位的抗原区的肽段由通式(Ⅱ)表示 A-异亮氨酸-Y1-Y2-赖氨酸-天冬氨酸-苏氨酸- 赖氨酸-谷氨酸-丙氨酸-亮氨酸-Y3-赖氨酸- (Ⅱ) 异亮氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺- 天冬酰胺-B 式中， Y1是天冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu)， Y2是缬氨酸(Val)或异亮氨酸(Ile)， Y3是谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)， A 是NH2或多达10个左右氨基酸的氨基酸序列， B 是COOH或多达10个左右氨基酸的氨基酸序列。 这些肽的氨基酸总数不超过40个，其本身是新的组合物，具通式(Ⅰ)和(Ⅱ)的肽的抗体也是新的组合物，同样，含这些抗体或肽的抗血清和疫苗也是新的组合物。 通式(Ⅰ)肽中X(X1-X10)可以是任何天然氨基酸即丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。类似地，当Ao表示1个或多个氨基酸时，它可包括任何组合物的任何上述氨基酸，或者Ao可以是在胸腺素α1的N端处与异亮氨酸相邻的氨基酸序列，即谷氨酸，丝氨酸-谷氨酸，丝氨酸-丝氨酸-谷氨酸，苏氨酸-丝氨酸-丝氨酸-谷氨酸，天冬氨酸-苏氨酸-丝氨酸-丝氨酸-谷氨酸，缬氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-丝氨酸-丝氨酸-谷氨酸等等。 当X1是苏氨酸，X2是苏氨酸，X3是亮氨酸，X4是赖氨酸，X5是赖氨酸，X6是谷氨酸，X7是缬氨酸，X8是缬氨酸，X9是丙氨酸和X10是谷氨酸时，通式(Ⅰ)的肽相应于胸腺素α1C端的C11-28并具有以下通式(Ⅰ)-1 Ao-异亮氨酸-苏氨酸-苏氨酸-赖氨酸- 天冬氨酸-亮氨酸-赖氨酸-谷氨酸-赖氨酸- (Ⅰ)-1 赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-缬氨酸-谷氨酸- 谷氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-COOH 在式(Ⅰ)中，特别可取的是X6是谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)，前者相应于在ARN-2的102位的谷氨酸(Glu)，后者对应于在HTLV-Ⅲ/LAV的102位的天冬氨酸(Asp)。 因为抗Tα1抗血清在中和爱滋病毒方面是有效的，可能氨基酸X1-X10，特别是X1-X5和X7-X10对抗体的辨认不太关键。 另一方面，在通式(Ⅰ)的肽中当X1是天冬氨酸，X2是缬氨酸，X3是苏氨酸，X4是丙氨酸，X5是亮氨酸，X6是谷氨酸，X7是赖氨酸，X8是异亮氨酸，X9是谷氨酸，X10是谷氨酰胺时，生成具通式(Ⅰ)-2的肽。 Ao-异亮氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-赖氨酸- 天冬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-谷氨酸-丙氨酸- (Ⅰ)-2 亮氨酸-谷氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-谷氨酸- 谷氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-COOH 其与ARV-2 gag蛋白在92至109位上完全对等，即100%的同源性，并提供更高效的爱滋病毒抗体。 类似地，当X1是谷氨酸(Glu)、X2是异亮氨酸(Ile)、X3是苏氨酸(Thr)、X4是丙氨酸(Ala)、X5是亮氨酸(Leu)、X6是天冬氨酸(Asp)、X7是赖氨酸(Lys)、X8是异亮氨酸(Ile)、X9是谷氨酸(Glu)、X10是谷氨酸(Glu)、生成具式(Ⅰ)-3的肽 Ao-异亮氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-赖氨酸- 天冬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-谷氨酸-丙氨酸- (Ⅰ)-3 亮氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-谷氨酸- 谷氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-COOH 其与HTLV-Ⅲ/LAVgag蛋白在92和109位上完全对等，并且提供特别有效的爱滋病毒抗体。 另外，在92至109位的爱滋病毒的核心蛋白的抗原在病毒再生过程中显然是关键的，同时也能方便地把多肽链长度从氨基酸序列的任一端或二端延伸至包括从1至10氨基酸(最好是1至8氨基酸，特别可取的是1至6氨基酸)，来提供具有从18至40氨基酸(最好是18至36氨基酸，特别可取的是18至30氨基酸)的多肽。但是，宁愿不要任意的氨基酸序列，特别可取的是向通式(Ⅱ)的肽的任一端或二端加上对应于在爱滋病毒中存在的序列的氨基酸序列(当然是被肽键连接着的一对上面所述的同样适用)。 相应地本发明的特别可取的具体实施方案中，提供了HTLV-Ⅲ/LAV，ARV-2的P-17gag蛋白的十八至三十肽段或相似的爱滋逆转病毒，包括氨基酸序列92至109以及其des-87类似物，它们具有通式(Ⅱ)-1 A1-异亮氨酸-Y1-Y2-赖氨酸-天冬氨酸-苏氨酸- 赖氨酸-谷氨酸-丙氨酸-亮氨酸-Y3-赖氨酸- (Ⅱ) 异亮氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺- 天冬酰胺-B 其中， Y1，Y2和Y3与上述通式(Ⅱ)中的定义相同 A 是下述基团中选择出的一个，它们是 NH2 精氨酸(Arg)， 谷氨酰胺-精氨酸(Gln-Arg)， 组氨酸-谷氨酰胺-精氨酸(His-Gln-Arg)， 缬氨酸-组氨酸-谷氨酰胺-精氨酸(Val-His-Gln-Arg)， 丝氨酸-缬氨酸-组氨酸-谷氨酰胺-精氨酸(Ser-Val-His-Gln-Arg)， 半胱氨酸-缬氨酸-组氨酸-谷氨酰胺-精氨酸(Cys-Val-His-Gln-Arg)， 酪氨酸-丝氨酸-缬氨酸-组氨酸-谷氨酰胺-精氨酸(Tyr-Ser-Val-His-Gln-Arg)， 酪氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-组氨酸-谷氨酰胺-精氨酸(Tyr-Cys-Val-His-Gln-Arg)， B1是从下述基团中选择出的一个，它们是 COOH， 赖氨酸(Lys)， 赖氨酸-丝氨酸(Lys-Ser)， 赖氨酸-丝氨酸-赖氨酸(Lys-Ser-Lys)， 赖氨酸-丝氨酸-赖氨酸-赖氨酸(Lys-Ser-Lys-Lys)， 赖氨酸-丝氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸(Lys-Ser-Lys-Lys-Lys)， 赖氨酸-丝氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸(Lys-Ser-Lys-Lys-Lys-Ala)， 由通式(Ⅰ)(Ⅱ)表示的本发明的肽可以用常规的合成肽过程来制备;更具体地说，是用Academic press，New York，U.S.A出版的，“肽类”Vol.1(1966)中Schroder和Lubke所述的或Maruzen出版公司出版的Izumiya等人所著“肽的合成”(1975)中所阐述的过程来制备，例如，叠氮化过程，氯化过程，酸酐化过程，混合酐过程，DCC过程，活性酯化过程(对硝基苯酯化过程，N-羟基丁二酰基亚胺酯化过程，氰甲基酯化过程等)，用Woodward反应剂K的过程，碳化二咪唑过程，氧化还原过程，DCC/附加剂(HONB，HOBt，HOSu)过程等。固相和液相合成对上述过程都适用。 本发明的肽是按照上述合成普通多肽的过程来制备的，通常是用所谓一步一步的过程来实现的，该过程包括把氨基酸一个接一个地缩合到终端氨基酸上，或者把分成几组的片段连接到终端氨基酸上，更详细地说，例如当采用固相合成时，C端氨基酸通过它的羟基接到不溶载体上。该不溶载体并不特受限，只要它与活性羟基有接合能力，而对该步骤的缩合-保护反应试剂及反应条件是惰性的即可。不溶载体的例子包括囟代甲基树脂如氯甲基树脂;特别是氯甲基-聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，溴甲基树脂等，羟甲基树脂，苯酚树脂，叔-烷氧羰基酰肼(Tertalkoxycarbonyl hydrazidated)树脂，交联的聚-N-烯丙酰-吡咯烷树脂等，例如，当在通式(Ⅰ)、(Ⅰ)-1、(Ⅰ)-2或(Ⅰ)-3的多肽中，其中C端氨基酸有-酰氨功能团 NH2-CH-COOH 如同在天冬酰胺(Asn)中那样时，可 ｜ ｜ CH2-CONH2 方便地使用二苯甲基胺树脂载体，借此可在树脂载体上直接形成酰胺功能团。另外按照特别可取的具体实施方案，生产通式(Ⅰ)的肽或任何其它C端氨基酸上包括酰胺功能团的肽固相合成过程是用甲基二苯甲基胺树脂载体来实现的，这一点在Su-Sun Wang 1986年4月8日申请的序号为849，835的一个已转让的共同未决专利中有详细说明，在这里已全部将该专利揭示的内容合并引用。 氨基保护基除去后，氨基保护的氨基酸按照所希望的氨基酸顺序联接成序列，例如通式(Ⅰ)所示的那样，通过活性氨基与活性羧基相缩合按顺序一步一步地合成。在完整的序列合成后，例如用HF，HBr或其它解离试剂将肽从不溶载体中分离出来以产生蛋白。 按照标准的习惯命名法，以上和以下叙述中的缩写代表如下意义 BOC，叔丁氧羰基;Bzl，苄基;DCC，二环己基碳二亚胺;Cbz，苄氧羰基;TFA，三氟乙酸;ClZ，2-氯苄氧羰基。 尽管下面介绍了特定的保护基团，但是使用常规的保护基团仍在本领域的技术范围之内。实施者很容易认识到，不管合成任种特定的肽，最好选择一些普通条件。例如，这是公认的，为了防止活性α-氨基功能参与的付反应，用于肽合成的每-氨基酸的α-氨基基团在偶联反应中必须保护起来。与此类似，对于那些具有反应功能的侧链基团(如硫氢基、ε-氨基、羟基、羧基)的氨基酸，其功能基团在具侧链基团的氨基酸的起始偶联过程中以及后继的氨基酸偶联过程中也都需要保护起来。合适的保护基团在现有技术中都是已知的。[如见，Protective Groups in the Organic Chemistry，由M.Mc Omie编辑，Plenum出版，N.Y.，1973] 在选择具体的保护基团时，必须考虑到下列条件α-氨基保护基团必须(1)在偶联反应中所使用的条件下，是稳定的且使得该氨基的功能变得无活性，(2)在将不会除去侧链保护基团或改变肽段结构的条件下，能够在偶联反应完成后很容易地被除去。侧链保护基团必须(1)在偶联反应中所使用的条件下，是稳定的且使该侧基功能基团变得无活性，(2)在去除α-氨基保护基团所使用的条件下是稳定的，(3)在不改变肽链结构或不改变对所含任何手性中心外消旋的反应条件下完成所需氨基酸序列后，能够很容易地被除去。α-氨基官能团的合适保护基团有叔丁氧羰基(BOC)、苄氧羰基(cbz)、联苯异丙基氧羰基、叔戊氧羰基、异冰片氧羰基、1，1-二甲基-2，5-二甲氧苄氧羰基、邻硝基苯基亚磺酰基、2-氰基-叔丁氧羰基、9-基甲氧羰基及其类似物，尤其是叔丁氧羰基(BOC)。 作为羧基保护基团的例子，可提到的有那些诸如能产生烷酯的成酯基团(如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基等酯)、苄基酯、对硝基苄基酯、对甲氧苄基酯、对氯苄基酯、二苯甲基酯等的成酯基团以及诸如那些能够产生苄氧基羰基酰肼、叔丁氧羰基酰肼、三苯甲基酰肼等的成酰肼基团。 作为精氨酸的胍基保护基团，应该提到的是硝基、对甲苯磺酰基(Tos)、对甲氧苯磺酰基、苄酯基、异冰片氧羰基、金刚烷基氧羰基等。胍基也可以通过与一种酸(如苯磺酸、甲苯磺酸、盐酸、硫酸等)形成盐而被保护起来。 苏氨酸的羟基可以通过例如已知的酯化或醚化方式被保护。应该提到的合适于该酯化的基团的例子有低级烷酰基(如乙酰基)、芳酰基(如苯甲酰基)和从碳酸衍生出的基团如苄氧羰基、乙氧羰基等。应该提到的合适于该醚化的基团的例子有苄基、四氢吡喃基、叔丁基等。但是，苏氨酸的羟基并非必要被保护。甲硫氨酸可以亚砜的形式被保护。特定氨基酸的较好侧链保护基团包括对于酪氨酸∶苄基、邻溴苄氧羰基(BrZ)2，6-二-氯苄基、异丙基、环己基、环戊基和乙酰基;对于组氨酸∶苄基、苄氧羰基、对甲苯磺酰基、三苯甲基和2，4-二硝基苯基;对色氨酸∶甲酰基。 作为C-末端氨基酸与固体树脂载体起始偶联的典型方法，提到下列准则。对于二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺树脂Nα-BOC-氨基酸或类似被保护的C-末端氨基酸是通过N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)/1-羟基-苯并噻唑(HBT)间接偶联而被附着到(甲基)二苯甲基胺基树脂上，它是在二氯甲烷或DMF(最好是-二氯甲烷)溶剂中于10-50℃(最好是25℃)的温度下反应2至24小时(最好是约12小时)而完成的。对于氯甲基聚苯乙烯二乙烯基苯型树脂对树脂的附着是通过Nα被保护的氨基酸尤其是BOC-氨基酸与氯甲基树脂在高温如40-60℃(最好是约50℃)下反应12-48小时(最好是24小时)来完成的，而这种氨基酸是以其铯盐、四甲基铝盐、三乙基铝盐、4，5-二氮杂二环[5.4.0]-十一碳-5-烯盐或其类似盐的形式存在于乙醇、乙腈、N，N-二甲基-甲酰胺(DMF)或其类似物中，尤其是以铯盐的形式溶于DMF。 Nα-被保护基团的去除可以在一种溶液中如三氟乙酸的二氯甲烷溶液、氯化氢的二氧六环溶液、氯化氢的乙酸溶液或其它强酸溶液，最好是50%三氟乙酸的二氯甲烷溶液于室温下完成。依次被保护氨基酸的偶联可以象现有技术中熟知的那样在自动多肽合成仪上进行。所加入的每一种被保护氨基酸最好过量2.5或更多的克分子，且偶联反应可以于室温下在二氯甲烷、二氯甲烷/DMF混合物、DMF及其类似物中进行，最好是在二氯甲烷中进行。其它已知的能够用于成肽缩合反应的溶剂如二甲基亚砜、吡啶、氯仿、二噁烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮等以及其合适的混合液也都可以使用。 缩合/偶联反应的反应温度可以选择在已知用于成肽缩合反应目的的温度范围内。因此，通常在约-40℃至60℃的范围内，最好在-20℃至0℃的范围内。偶联剂通常是溶于二氯甲烷中的DCC，但也可以是单独的N，N′-二-异-丙基碳化二亚胺或其它碳化二亚胺，或者是在HBT、N-羟基丁二酰亚胺、乙基2-肟基-2-氰基乙酸盐、其它的N-羟基酰亚胺或肟存在下的N，N′-二-异-丙基碳化二亚胺或碳化二亚胺。或者，也可以利用被保护的氨基酸活性酯(如对硝基苯基、五氟苯基及其类似物)或对称酐。 多肽衍生物的偶联、去保护/解离反应及其制备在约-10至+50℃的温度下进行较好合适，尤其是在20-25℃。当然，对于任何一种具体反应，其精确温度将取决于底物、试剂、溶剂等等，所有这些都在实施者的技术范围之内。完全去保护的多肽然后可通过使用一套色谱法步骤中的任一或全部类型来进行纯化乙酸盐形弱碱树脂上的离子交换;凝胶渗透色谱法，如在葡聚糖凝胶(Sephedex)G-25上;在非衍生的聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如Amberlite XAD)上的疏水吸附色谱法;硅胶吸附色谱法;;离子交换色谱法，如在葡聚糖凝胶G-25上，或去逆流分配;高压液相色谱法(HPLC)，尤其是装有辛基-十八基硅甲基-硅胶的逆相HPLC。 尽管本发明的合成肽可以通过上面所述的化学的制备方法来制备，尤其是上面所述的具有高效率的固相肽合成，但是采用现有技术中所熟知的遗传工程技术来生产新型具通式(Ⅰ)的胸腺素肽段或其类似物或具通式(Ⅱ)核心蛋白肽段及其类似物也在本发明的范围之内。因此，利用合适的酶和微生物(如大肠杆菌等细菌)可以将编码为所需多肽的DNA序列整合进微生物的基因组中，然后使得该微生物表达所需的特定多肽。 一旦获得和纯化了某种多肽，就可以用它作为半抗原来制备一种抗原免疫原，从这一抗原可大量地和稳定地获得抗体，该抗体对HTLV-Ⅲ/LAV、ARV-2及类似爱滋病毒的核心蛋白具有特定的交叉反应能力，并且具有对爱滋病毒的中和能力。因此，特定的抗体可以与上面所述的对于胸腺素α1的抗体相似的方式被使用，即作为抗血清来抑制爱滋病病毒的复制。通过将这些抗体与亲和层析的载体相结合，在亲和层析中利用结合的抗体可以对HTLV-Ⅲ/LAV、ARV-2等进行纯化。特定的抗体也可被用作HTLV-Ⅲ/LAV、ARV在各种免疫学测定中的特定抗体。因此，本发明抗体具有直接诊断血液血清中存在的爱滋病病毒的价值，专一性高。 在这些诊断方法中，显示p17gag蛋白抗原性的多肽以及由它们所产生的抗体可以分别用来测定爱滋病毒的抗体或爱滋病毒本身的存在。这些多肽以及它们的抗体可以单独地包装在诊断箱中，也可与任一或所有其它HTLV-Ⅲ/LAV、ARV等抗原和抗体结合后包装在诊断箱中。通过这些方法和诊断箱，单独利用本发明的多肽或抗体或者是与其它的抗原或抗体相结合，就可以迅速和简便地鉴定感染爱滋病的携带者、预测爱滋病综合症及爱滋病的病程。下面简要叙述检测爱滋病毒典型的放射免疫测定和酶联免疫吸附测定(ELIASA)。 检测爱滋病毒的放射免疫测定将胸腺素α1的抗体、至少包含分别位于胸腺素α1的11、14、15、17、18、24、25及对位置的异亮氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸、谷氨酸及天冬酰胺等氨基酸的胸腺素α1的多肽片段或其类...
【专利技术属性】
技术研发人员：阿兰，L戈尔茨坦，王苏三，
申请(专利权)人：维拉尔技术公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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