纯化的胎儿胸腺嘧啶脱氧核苷激酶制造技术

本发明专利技术从一种新的工业产品的形式涉及纯化的胎儿胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（缩写为ＴＫ－Ｆ，简称胎儿胸苷激酶）。本发明专利技术揭示了制备纯化的胎儿胸苷激酶的方法，包括将ＴＫ－Ｆ与胸苷偶联，再切开所得到的ＴＫ－Ｆ／胸苷复合物。根据本发明专利技术，所纯化的ＴＫ－Ｆ可应用于制备抗ＴＫ－Ｆ抗体，该抗体可作为定量分析试剂和药物。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术以一种新的工业产品的形式涉及纯化的胎儿类型的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶，还涉及到制备此产品的方法，尤其是纯化该产品的方法。该产品可应用于(ⅰ)定量分析，尤其是含有抗原-抗体反应的免疫学分析;(ⅱ)制备用作药物的抗体。胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(TK)，负责胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化为5′-单磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷(d-TMP)，在DNA合成并从而在细胞再生过程中起重要作用。在处于增殖和再生的组织中以及被病毒感染的细胞中TK活力高。在真核细胞中检测到TK的两种同功酶胎儿类型的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(此后称为“胎儿胸腺嘧啶脱氧核苷激酶”或TK-F)和成熟型胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(此后称为“成熟胸腺嘧啶脱氧核苷激酶”或TK-A)。TK-F出现于胚性组织，并在依赖于激素的癌症的癌性组织，尤其是乳腺癌和前列腺癌中被检测到，参见J.L.Javre′et al.in Bull.Cancer(Paris)73(No.1)，第8-16页(1986)，题目是“Mise en evidence de la thymidine kinase de type foetal dans les cancers du sein”(即乳腺癌中胎儿型胸腺嘧啶脱氧核苷激酶的检测)和J.L.Javre′ et al.的文章，已投送Cancer Research待发表，题目“胎儿型胸腺嘧啶脱氧核苷激酶在人类乳腺癌中的存在”。还已知各种性激素在它们的靶器官，即前列腺和子宫中大大激增体内TK-F的合成;参见M.Bourtourault et al，in J.Steroid Biochem.，21(No.5)，第613-620页(1984)，题目“大鼠子宫中17β-雌二醇对胸腺嘧啶脱氧核苷激酶活力的刺激。”以及G.Gayet et al.in The Prostate Ⅰ，第261-270页(1985)，题目“大鼠前列腺中雄性激素诱导胎儿胸腺嘧啶脱氧核苷激酶。TK-F从TK-A的分离采用电泳或阴离子交换树脂层析方法，例如丙烯酰胺凝胶电泳，或更倾向于采用DEAE-纤维素凝胶或DEAE-葡聚糖凝胶层析，上述凝胶由Pharmacia公司出售，胎儿型同功酶具有零或低迁移率，成熟型同功酶则迁移很快。以这种方式分离的TK-F所具有的酶活力为每毫克2国际单位，不适于(ⅰ)进行更为准确的定量分析，尤其不适于(ⅱ)制备多克隆特别是单克隆抗TK-F抗体，后者用于诊断和治疗领域。根据本专利技术第一个特点，以一种新的工业产品形式，提出一种纯化的TK-F，它比到目前为止文献所用方法分离得到的TK-F具有显著大的酶活力。诊断特别需要纯化的TK-F，事实上，TK-F活力随癌症的类型而变。正如TK-F活力在处于Go期的细胞中很低，而在处于S期细胞中很高，有充分理由相信显示低TK-F活力的癌症处于静止状态，而显示高的TK-F活力的癌症处于增生状态。定量分析乳腺癌和前列腺癌中的TK-F对于确定癌症增生状态具有重要意义。此外，用抗纯化的TK-F的抗体定量分析TK-F成为估计癌变发展并确定治疗方向的一个因素。根据本专利技术的第二个特点，推荐一种制备所述纯化的TK-F的方法，该方法包括将需纯化的TK-F与胸腺嘧啶脱氧核苷偶联，然后切开所得到的复合物(胸腺嘧啶脱氧核苷TK-F)以收集纯化的TK-F。根据本专利技术的另一特点，推荐该纯化的TK-F应用于制备抗-TK-F抗体，这些抗体将用于诊断和治疗。出乎意料的是，确实发现将抗-TK-F抗体给患有激素依赖性癌症(特别是乳腺癌如前列腺癌)的病人服用，具有有益的治疗效果。据本专利技术，以一种新的工业产品形式，推荐一种他人迄今尚未得到的纯化的TK-F，可用于定量分析和制备抗TK-F抗体，该纯化的TK-F具有酶比活力每毫克大于或等于5000单位，优选大于或等于8000单位，最佳为大于或等于10，000单位。具有酶比活力11，800单位/毫克的纯化的TK-F，在非变性介质(例如下面所述A和B缓冲液)中电泳的Rf值(pH约8.6)为0.15。按常规酶比活力表达为每毫克蛋白的酶单位。所谓TK-F的国际单位是每分钟每毫克蛋白合成1毫微摩尔核苷酸。换言之，酶活力可表达为nmol/mg蛋白/分钟。(nmol/mg of protein/min)通过比较，从下面例1中可以看到-原始生物介质中活力为1.03nmol/mg蛋白/min;-DEAE-葡聚糖层析后活力为2.08nmol/mg蛋白/min;-纯化的TK-F活力为11，875nmol/mg蛋白/min;据本专利技术推荐的制备纯化的TK-F的方法为待纯化的TK-F与胸腺嘧啶脱氧核苷偶联，然后切开胸腺嘧啶/TK-F复合物，包括a)与胸腺嘧啶脱氧核苷偶联，即，将待纯化的TK-F与胸苷接触，胸苷已提前固定于适当的第一载体上。b)用适当的含胸苷的洗脱液洗脱以这种方式结合于胸苷的TK-F;c)切开以这种方式洗脱的胸苷/TK-F复合物，用区别于第一状态的第二载体从该复合物上选择性地吸收胸苷。进行这种方法的最佳方式包括所谓竞争机制的亲和层析。因此，在步骤a)，待纯化的TK-F通过适当的已予先与胸苷偶联的树脂。结合于该树脂上的胸苷固定了TK-F并且被保留，而污染或感染TK-F的蛋白质类型的杂质不会固定于胸苷，因而不会停留。步骤b)中，通过予先偶联于载体的胸苷而固定在载体上的TK-F用含有游离胸苷的洗脱液洗脱。步骤b)包括所谓竞争机制，借此，结合于固定在载体上的胸苷的TK-F与洗脱液中的游离胸苷偶联。以此方式收集的洗脱液含有所得到的胸苷/TK-F复合物。步骤c)中，该胸苷/TK-F复合物通过吸收在对于胸苷为选择性的第二载体上的胸苷而去稳。实用中，步骤c)中的优选载体是一种Pharmacia公司出售的环氧-琼脂糖凝胶，称为环氧-琼脂糖6B，此胶按一已知方法首先与胸苷偶联，尤其是下文所述方法P.Grobner et al.in J.Biol.Chem.，259，pages 8012-8014(1984)，或一与之相似的方法。步骤c)优选的用于固定胸苷的载体是包括木炭，葡聚糖和明胶的组合物。分离纯化的TK-F，特别是采用离心的方法，离心含有TK-F和用于步骤c)中第二载体的洗脱液。原始TK-F是一种蛋白质物质，源于动物(从胚胎动物组织中得到，特别是啮齿类如大鼠的胚胎的肝中得到)或源于人类(从癌症病人组织中得到)再者就是源于合成产品(特别是用基因工程得到)。据本专利技术以这种方式纯化的TK-F，可应用于制备抗-TK-F抗体，这些抗体是单克隆优先于多克隆。它们均可用已知方法得到。例如，用该纯化的TK-F接种一只小鼠，从免疫动物体内移去脾脏，从中提取脾淋巴细胞，脾淋巴细胞与处于指数生长期的小鼠骨髓瘤细胞融合，比例为5～20，优选为10淋巴细胞/骨髓瘤细胞，筛选得到的分泌杂交瘤，以获得单克隆抗体，其选择性地与TK-F反应但不与TK-F反应，用筛选的克隆于小鼠体内生长腹水瘤，采集含有抗体的腹水，纯化所得到的单克隆抗体。为进行分析TK-F在组织中是否存在或定量估计TK-F在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备纯化的胎儿胸苷激酶（ＴＫ－Ｆ）方法，该ＴＫ－Ｆ具有大于或等于每毫克５０００单位的酶活力，该方法包括将待纯化ＴＫ－Ｆ与胸苷偶联，再切开得到的胸苷／ＴＫ－Ｆ复合物，该方法的特征在于：ａ）把待纯化的ＴＫ－Ｆ与予先固定于适当的第一载体上 的胸苷相接触将ＴＫ－Ｆ与胸苷偶联，ｂ）以这种方式结合的ＴＫ－Ｆ用含有胸苷的适当溶剂洗脱。ｃ）以这种方式洗脱的胸苷／ＴＫ－Ｆ用第二载体切开，第二载体不同于第一载体并从该胸苷／ＴＫ－Ｆ复合物上选择性吸收胸苷。

【技术特征摘要】
FR 1986-7-31 8611 1011.一种制备纯化的胎儿胸苷激酶(TK-F)方法，该TK-F具有大于或等于每毫克5000单位的酶活力，该方法包括将待纯化TK-F与胸苷偶联，再切开得到的胸苷/TK-F复合物，该方法的特征在于a)把待纯化的TK-F与予先固定于适当的第一载体上的胸苷相接触将TK-F与胸苷偶联，b)以这种方式结合的TK-F用含有胸苷的适当溶剂洗脱。c)以这种方式洗脱的胸苷/TK-F用第二载体切开，第二载体不同于第一载体并从该胸苷/TK-F复合物上选择性吸收胸苷。2.根据权项1的方法，其中第一载体是环氧-琼脂糖。3.根据权项1的方法，其中未停留在已偶联了胸苷的第一载体上的蛋白质类型的杂质，用下述缓冲液洗脱10mM Tris，10mM Mg Cl2，5μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼里尼科拉斯约安，
申请(专利权)人：皮埃尔茹昂，
类型：发明
国别省市：FR[法国]