细胞生长速率的测定制造技术

测定体内和体外细胞生长率的方法。用花青染料标记细胞，用质膜上花青染料水平的变化测定生长率。利用细胞生长率测定检测移植的骨髓细胞的植入和手术后角膜上皮细胞的生长。所发明专利技术的方法还用于测定肿瘤细胞对肿瘤治疗剂的敏感性、酵母对抗真菌剂的敏感性和细菌对抗菌剂的敏感性。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本项专利技术涉及到测定体内和体外细胞生长速率的新方法。目前有两种测定细胞生长的普通方法。一种方法是在分析阶段开始时计细胞的数量，而后在该阶段结束时再计细胞的数量，从而测定出细胞数量的增多。可用血球计数器利用显微镜方法进行细胞计数，或用库尔特(Coulter)计数器或其它的流式血细胞计数器利用仪器辅助的方法进行。测定细胞生长的另一种方法是用β计数法测定细胞对氚标记的胸腺嘧啶核苷的吸收。按照这个方法，在实验开始时测定细胞的数量，而后在细胞中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷，以定期的间隔取出一份培养液，计数，洗去未结合的氚标记胸腺嘧啶核苷，并将洗过的这份细胞用三氯乙酸(TCA)沉淀，然后对放射标记了的固体沉淀物进行闪烁计数，从而测定氚标记胸腺嘧啶核苷对DNA的掺入。这个方法测定的只是DNA的合成速度，而并非细胞生长本身。但由于这个方法相对简单，因此常被选用于观察细胞的兴奋。用于测定细胞增殖活动的另一种方法是测定在所考察的组织中，每一百个细胞中进行有丝分裂的数量。这种方法不十分精确，因为在制备过程中会损失细胞。一般说来，这些方法能较好地测定体外细胞生长，但对于体内测定细胞生长则是十分困难的。取出组织并在体外监测有规律的氚标记胸腺嘧啶核苷的掺入，就可以判断组织的生长速率。将组织切成30μm的切片，与氚标记的胸腺嘧啶核苷接触30分钟，洗去未掺入的氚标记胸腺嘧啶核苷，在切片上涂一层核乳胶，并对胶片曝光放射性同位素的衰变。对乳胶显影和定影。组织用苏木精和伊红染色，然后镜检以测出被标记的部分。这种方法既费时又费力。花青染料已广泛应用于生物学，二噁羰花青染料(dioxacar-bocyanine dyes)已用于进行白血细胞分类计数，Gunter Valet，Max Planck Ges Wissensch;登记专利号84-102307/17，“用选择性染色并测定体积和荧光法同时定量测定血细胞”。但是，在这些研究中，所用的染料是一些短链的羰花青染料(少于10个碳)，对细胞膜电位的变化有反应。同时，这种短链的羰花青染料进入细胞的线粒体，有细胞毒性，当洗涤细胞时，无论细胞膜电位是否发生变化，这种染料都易于从细胞中漏出来。其它的短脂肪链花青染料用于许多其它生物学分析中。但是这些短链的分子对细胞膜电位的变化有反应并穿过细胞膜进入线粒体。H.M.Shapiro，美国专利号4，343，782，1982年8月10日。这些短链染料对细胞也是有毒的，不能用于测定细胞的生长速率。三羰花青染料(Fox，I.J.，et al.，Proc.Mayo Clinic，62∶478-484，1957)和伊文思蓝染料(Schad，H.，et al.，Pfluegers Arch.Eur.J.Physiol.，370(2)∶139-144，1977)已经以稀释法用于体内测心输出量。Dow(Dow，P.，Physiol.Rev.，36∶77-102，1956)描述了这个方法，其做法是在肺的静脉端注射已知量的某种血管内指示剂，并测定动脉血管内指示剂浓度随时间的变化，从而确定注射点和取样点之间的体积。这些染料不能用来染色细胞。本项专利技术是测定细胞生长速率的新方法。按照本专利技术，首先用花青染料标记活细胞。测定被花青染料标记的母细胞所产生的子细胞质膜中花青染料水平的变化，确定细胞生长速率。例如本专利技术的测定生长的方法可用于在体内监测角膜上皮的愈合、移植骨髓细胞的植入。本专利技术的方法在体外的用途包括测定肿瘤细胞对各种化疗剂的敏感程度。图1是细胞的荧光强度随时间而降低的图示。图2是染色和未染色细胞的生长曲线的图示。图3显示染料不从染色细胞向未染色细胞转移。图4是细胞和荧光动力学的比较的图示。在本项专利技术的测定细胞生长速率方法中，细胞被花青染料标记。有以下结构的化合物在本文中归为花青染料 其中Y为氧、硫、亚甲基或烷基取代的亚甲基;m为0-3;n为12-22。在此所用的烷基取代的亚甲基是指具有与甲基、乙基或丙基取代基的任何结合的单或双取代的亚甲基。上述结构的化合物可用下述通用的速记公式表示DiYCn(2m+1)Sims，P.J.，et al.，Biochem，13∶3315(1974)。因此，例如在这个化合物中Y是硫，有3个将环联结的碳原子，还有2个14碳的脂肪链，那么就可写为DiSC14(3)。相似地，DiIC14(5)表明这个化合物中Y是异丙基，有5个碳原子将环联结，并有2个14碳的脂肪链。在本文中记叙为花青染料的化合物包括有一个或一个以上取代的上述结构的化合物，假定这种取代的化合物能在细胞标记介质中至少能溶解至标记完成，并且具有足够高的膜分配系数，使得它能维持与标记的细胞膜相联结。在标记所要求的浓度范围内，这种化合物还必须不显著影响细胞的活力。化合物在细胞标记反应介质中的溶解度的测定方法如下将花青染料分散到标记介质中，用一般的荧光分光光度技术测定荧光强度随时间的变化。荧光强度减小说明染料沉淀并吸附在容器壁上。测定染料是否与细胞膜相结合例如将标记后的血红细胞重新注射入供体动物，并用流式血细胞计数方法监测其荧光强度。注入后，标记细胞荧光强度基本不变说明染料在细胞膜上的稳定性。本专利技术所用的花青染料可从多处购得，如Molecular Pro-bes，Inc.，Eugene，Oregon，或用已知的合成方法从现有的原始材料制备，Hamer，F.M.，“花青染料及有关化合物”，Inte-rscience Publishers(1964)。用所描述的步骤，任何活细胞都可被花青染料标记。本文中“细胞”这个术语包括有核细胞如白血细胞、各种肿瘤细胞、其它哺乳动物细胞(例如组织培养细胞)，酵母和细菌。如果一个细胞能够生长并基本上能发挥它那类细胞所该有的功能，那么它就是活细胞。细胞标记是在对细胞无毒并使细胞标记可重复的介质中进行的。为了使介质具有这些必要的特性，所使用的渗透压调节剂要使得花青染料能在其中形成稳定的溶液，至少要稳定标记所需的同样长的时间。可接受的渗透压调节剂包括例如糖，象单糖，如葡萄糖、果糖、山梨糖、木糖、核糖，二糖，如蔗糖，糖醇，如甘露醇、甘油、肌醇、木糖醇和阿东糖醇，氨基酸，如甘氨酸和精氨酸，以及一些Good′s缓冲剂如N-三(羟甲基)-甲基-3-氨基丙磺酸和如下面表2中所列的化合物。Good，N.E.，et al.，Biochem.15，467-477(1966)，Good，N.E.and S.Izawa，Methods Enzymol.，24，Part B，53(1968)，Feguson，W.J.，et al.，Anal.Biochem.104∶301-310(1980)。但某些细胞株可能对一种或多种渗透压调节剂敏感，特别是对糖醇。因此，在标记前，要进行一些标准的实验以确定细胞在这些所要用的渗透压调节剂中是有活力的。此外，在标记反应液中可加少量缓冲剂以调节氢离子的浓度。接触各种渗透压调节剂对细胞生存力的影响可由测量Yac细胞在接触各种渗透压调节剂30分钟后的倍增时间来确定。Yac细胞是小鼠淋巴瘤组织培养细胞株，公众可由American TyPe Culture 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定细胞生长率的方法，包括测定来自用花青染料标记的母细胞的子细胞的质膜中花青染料水平的变化。

【技术特征摘要】
US 1986-10-31 925,429的限定。实施例1组织培养细胞的染色方法Ⅰ.细胞的准备利用对数期的组织培养细胞能得到最佳结果。从培养器皿中取出悬浮培养物，放到聚丙烯离心管中。如果用的是单层培养，必须除去上清液，用不含钙和镁的磷酸盐缓冲液洗涤贴壁细胞，以除去培养瓶中的血清蛋白。加入胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco Laboratories，Grand Island，New York，＃610-5300)，覆盖培养瓶的底部，室温下培养，直至细胞单层松动并解聚。将所得的细胞悬浮液转移到聚丙烯离心管中，加入等体积的含10%小牛血清(FBS)(Hazelton)的培养液，以终止胰蛋白酶的酶作用。细胞在室温下以400×g离心10分钟。吸出上清液，代之以等体积的等渗甘露醇以重新悬浮沉淀的细胞。用甘露醇洗涤的目的是除去细胞悬浮液中的血浆蛋白，并准备对细胞进行染色。细胞在室温下以400×g再离心10分钟。吸出上清液，所得的细胞沉淀再悬浮于甘露醇溶液中，使每毫升悬浮液中含2×106个细胞，以便染色。但有些细胞株对糖醇(甘露醇)的使用敏感，在这种情况下可用等渗的葡萄糖溶液(MW 180.16，54.05g/l)。Ⅱ.染料原液的制备用无水乙醇配制2×10-3M的原液如下DiO-C14(3) MW 800(1.600mg/ml)DiS-C14(5) MW 814(1.628mg/ml)DiO-C18(3) MW 936(1.872mg/ml)DiI-C14(5) MW 850(1.700mg/ml)从Molecular Probes，Eugene，Oregon得到所有的染料。染料原液经超声处理使其完全溶解并减少对试管的粘附。用聚苯乙烯管来制备原液以便能观察到染料的溶解情况。但是，用聚丙乙烯管来进行细胞染色，因为与聚苯乙烯相比，染料在水性环境中对聚丙乙烯的粘附要少得多。Ⅲ.细胞染色细胞在等渗甘露醇溶液中调到浓度为2×106个细胞/ml。按每毫升细胞悬浮液中加2×10-3M的染料原液5μl将染料原液加到染色溶液中，使终浓度达到10μM，将染色的样品用吸管吹吸或搅拌使其充分混合。细胞与染料共孵育十分钟后，取一小份样品在荧光显微镜下观察，以确认已产生强烈而均匀的染色。对于DiO系列的染料，使用对488nm的激发光具有选择性的显微镜滤光片，而DiS和DiI染料系列则需在靠近575nm激发，以观察荧光。保温后，于染色细胞悬浮液中加等体积的PBS。细胞在20℃下以400×g离心10分钟。吸出上清液，用PBS将沉淀重新悬浮。重复离心过程，观察所得上清液中是否有染料存在。如果上清液中仍有染料存在，重复洗涤直到用荧光分光光度法测不出上清液中有染料为止。最后一次洗涤后，除去上清液，将沉淀重新以所需浓度悬浮于合适的培养液中。全部操作均在无菌条件下进行。实施例2组织培养细胞生长速率的测定按实施例1中所述的方法用DiOC14(3)对V79细胞进行染色。用EPICS753型流式血细胞计数器测定荧光强度(Coulter Elec-tronics，Inc.)。染色后立即取一份被染色的细胞测定荧光强度，其余的细胞在标准完全培养介质中，37℃于湿润的空气-CO2(7.5%CO2)培养箱中培养，在染色后的第一天、第二天、第三天分别取细胞样品进行荧光强度测定。图1显示生长中的V79细胞荧光强度对数的曲线。每一个峰上标出的数值是那一天平均荧光强度值的对数值。如图1所示，随着培养细胞的生长，荧光强度的平均对数值逐天减小。通过对荧光的测量，从与荧光强度的对数对时间所做曲线的直线部分配合的回归线的斜率，可测定出生长速率。为了确认细胞染色并不影响其生长速率，比较了被染色的V79细胞和未染色的V79细胞的生长率。图2的结果表明，未染色的细胞与用10-5或4×10-5M染料染色的细胞，或与未染色细胞和染色细胞的等量混合物，以同样的速率生长。因为染料由染色细胞向未染色细胞转移将引起生长率测定不正确，所以将染色与未染色的细胞放在一起共同培养。将一株人类结肠癌细胞株HT29(可由American Type Culture Collection，Rockville，Maryland得到，由J.Fogh and G.Tremp，《人类体外癌细胞》，PP.115-159.Plenum Press，New York(1975)描述)用DiOC14(3)染色，并将它与人前骨髓白血病细胞HL60(可由American Type Culture Collection，Rockville，Maryland得到，由Collins，S.J.，et al.，Nature，270∶347-349(1977)描述)以1∶1的比例共同培养。所得的结果示于图3。图3中，单独培养的染色的HT29细胞的荧光强度(菱形点)表明荧光强度随培养时间而降低的特征。未染色的HL60细胞在4天内几乎无荧光，4天后荧光强度显示大约中等程度的增加。进一步，染色的HT29细胞与HL60细胞共同培养(方形点)，直到大约第5天以前，其荧光强度的损失与没有和HL60细胞一起培养的HT29细胞荧光强度的损失完全一样，此后只出现一些额外的、但只是极小量的荧光强度的损失。从这些数据可清楚地看到，HL60细胞在与HT29细胞培养4天后也许也吸收一些荧光染料。但是应该注意到HL60细胞是前髓细胞，具有某种吞噬细胞和细胞碎片的能力。培养4天后混和培养中未染色亚种群所经历的荧光强度的增强或许实际上是由于它们吞噬了有荧光的碎片的结果。更重要的是在4天的培养中，在未染色的HL60细胞中荧光强度没有增加。再者，在同一混合物中染色的HT29细胞的荧光动态与未经混合的HT29细胞的荧光动态表现一致。因此，并未因细胞与细胞间染料的转移而导致错误的生长率测定。实施例3肿瘤细胞生长率的测定如果研究的肿瘤细胞是适应于体外培养条件的组织培养系，那么就按实施例1及实施例2中所述的方法进行细胞染色和测定。如果研究的细胞来自肿瘤组织外植体，那么就用一般技术将其打散成单个细胞，把它们涂到Lab-Tech组织培养箱的载片上。按实施例1中所述的方法用花青染料染色细胞。然后放在37℃湿润的空气-CO2培养箱中保温进行平衡。每隔一段时间，将载片放在贴壁细胞分析仪(即Meridian ACAS470)的显微镜镜台上测定荧光强度。细胞相对于参比标记的位置可用计算机进行测定，所以能进行一系列的荧光强度测定。将载片放回培养箱中，使细胞继续生长。显微镜载片上应有荧光标准，如库尔特(Coulter)全光聚苯乙烯微球(Coulter Electronics，Hialeah，Florida)，使得在培养过程中荧光强度不随时间而变化。此标准即用来进行荧光强度测量比较。可用显微镜上的相镜片测量形态学参数，或用荧光标记的对肿瘤细胞特异的单克隆抗体，将肿瘤细胞从正常基质细胞中鉴定出来。细胞生长的测定则是监测肿瘤细胞在每次分裂后花青染料荧光的稀释，并应用实施例9中的公式。也可用流式血细胞计数器来测定荧光强度。但是在进行流式细胞分析前需将细胞从显微镜载片上取下来。这种方法不能用同一个细胞每天进行测定而进行染料稀释的一系列定量分析。但在某些例子中，如白血病细胞，这种方法较好。测定体外细胞生长是用在最适培养基质中培养的细胞或用在各种水水平的治疗肿瘤制剂存在下培养的细胞。治疗剂抑制肿瘤细胞生长的能力可通过抑制荧光强度的降低来测量，这可用于测定制剂杀伤肿瘤细胞的效力。实施例4白血细胞生长速率的测定用常规技术由脾脏切除术或静脉抽血法取淋巴细胞。用实施例1的方法以花青染料标记细胞，但是用葡萄糖或蔗糖代替甘露醇作为渗透支持介质。被染色的细胞分置到微量滴定板的每一个孔中，每孔5×105个细胞(Mazumder，A.，Grimm，E.A.，Zhang，H.z.，and Rosenberg，S.A.，Cancer Res.42，918(1982))，与适当的细胞分裂素如白细胞介素-2、高碘酸钠、植物凝集素、伴刀豆球蛋白A、美洲商陆(Pokeweed)细胞分裂素和B细胞生长因子(BCGF)一起培养，将细胞放在37℃湿润的空气-CO2培养箱中使细胞生长。隔一定的时间将细胞从培养容器中取出，用流式血细胞计数技术测定。得到的数据同实施例2得到的数据类似，并用实施例9中的方程进行分析。实施例5细菌生长率的测定用实施例1中的方法以花青染料标记细胞，但是用葡萄糖或蔗糖代替甘露醇作为渗透支持介质。被染色的细胞按每一小孔中5×105个细胞的水平分置于微量滴定板的各个含有肉汤培养液的小孔中，将细胞放入37℃湿润的培养箱中使细胞生长。隔一定时间，将细胞从培养容器中取出，用流式血细胞计数方法测定。测得的数据与实施例2中所得的数据类似，并用实施例9中的方程分析。测定体外细胞生长的方法是用在最适培养基质中培养的细胞或在有不同水平的抗生素存在下培养的细胞进行的，加入抗生素是为了测定它们的抗菌能力。用对细胞荧光强度减小的抑制程度来测定杀菌剂抑制细菌细胞生长的能力，这个能力是这种制剂杀死细菌有效性的指标。实施例6酵母生长率的测定用实施例1中的方法用花青染料标记细胞，但用葡萄糖或蔗糖代替甘露醇作为渗透支持介质。被染色的细胞以每个小孔中5×105个细胞的水平分置于微量滴定板上的每个含有肉汤培养液的小孔中。将细胞置于培养箱中使其生长。隔一定时间，从培养容器中取出细胞，并用流式血细胞计数法或贴壁细胞测定法(Meridian ACAS470)进行测定。所得的数据与实施例2得到的数据类似，并用实施例9中的方程进行分析。测定体外细胞生长的方法是用在最适生长基质中培养的细胞，或是在待测其抗真菌能力的化合物以各种所选水平存在下培养的细胞进行的。杀真菌剂抑制真菌细胞生长的能力，可由其对细胞荧光强度降低的抑制来加以测量，这种能力是这种制剂杀真菌效力的一个指标。实施例7骨髓细胞生长率的测定在胸骨或髂骨嵴处用吸出法(Illinois针头)或中心活组织检查法(Jamshiti针头)取出骨髓细胞。按实施例1中的方法用花青染料标记细胞，但是用葡萄糖或蔗糖代替甘露醇作为渗透支持...

【专利技术属性】
技术研发人员：保罗卡尔霍兰，布鲁斯戴维詹森，休埃伦斯莱扎克，
申请(专利权)人：史密丝克莱恩贝克曼公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]