采用杂交测定人体Ｔ细胞白血病病毒I和II制造技术

在含有一个或一个以上核酸的样品中，是否存在ＨＴＬＶⅠ和ＨＴＬＶⅡ两者分离体或ＨＴＬＶⅠ或ＨＴＬＶⅡ的分离体的核酸顺序，以及怀疑含有这样的顺序可通过下述方法来测定，即采用引物扩增顺序以形成延长产物作为模板和测定扩增的产物，如果它是存在的话。这可以通过把一种附加的标记杂交探针加到已扩增的产物上，或者游离于溶液中或固定在载体上来实现。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及一种测定病毒中的核苷酸顺序是否存在的方法，该病毒涉及人体T细胞白血病病毒Ⅰ型和Ⅱ型(HTLVⅠ和Ⅱ)。本专利技术还涉及一种用于在引物和标记的杂交探针存在下的这样测定的装置。人们已知道，某些T细胞肿瘤的发病机理中涉及到一族T细胞热带还原病毒，称为人体T细胞白血病病毒(HTLV)。目前，已知道有三种类型的HTLV。第一，Ⅰ型(HTLVⅠ)是一种肿瘤病毒，它和在日本、加勒比海地区和非洲所发现的人类成年人T细胞白血病淋巴细胞瘤(ATLL)有密切的联系。第二，Ⅱ型(HTLVⅡ)是一种肿瘤病毒，它是从具有毛发状细胞白血病的T细胞变株的两个病人中分离出来的。参见M.Popovic等，《Science》224卷497～500页(1984)和Rosenblatt，J.D等，New Eng.J.of Med.，8月号(1986)。第三，Ⅲ型(HTLVⅢ)是一种慢病毒，是一种引起艾滋病(AIDS)的病原体，艾滋病是一种会传染的细胞免疫系统的疾病，会引起常是致命的感染。用对付HTLV相关病毒，如艾滋病的抗体鉴定血清的免疫诊断试验(参见美国专利第4，520，113号，Gallo等)正在血库中被用于排除潜在感染的血液。也可参见WO86/01834，1986年3月27日公布(加利福尼亚大学)，它是用在制备单克隆抗体中有用的还原病毒多肽去测定HTLV族中的还原病毒。因为这种病毒属于一种不产生有效数量病毒颗粒的DNA复制品，一种测定HTLVⅠ和Ⅱ型有关的病毒的直接免疫方法用于很大部分的无征状个体持久感染被证明是不成功的。因为在感染组织和血液中病毒颗粒的数量可能是很少的(因为病毒的休眠)，病毒颗粒或RNA/DNA的直接测定可能是相当困难的，如果不是办不到的话，不要把感染细胞与合适的T细胞系进行共同培养。美国专利第4，683，202号(1987年7月28日公布)中，K.Mullis描述了一种通过采用一种标记的RNA或DNA杂交探针放大核酸顺序以促进测定的方法。在这个方法中，引物被用于得到引物延长产物，该延长产物用作核苷酸存在下合成附加的互补链的模板。该专利申请案中也描述了一种技术，即在探针被杂交至所需要的顺序上以后，再加上一种限制性内切酶以使在所需要的顺序内的某一位置上裂解杂化物，然后对限制性消化进行分析以了解标记片断。美国专利第4，683，194(1987年7月28日公布)，以及《生物技术》第3卷1008～1012页(1985)中H.Erlich等和Saiki等写的文章中，更详细地描述了这一后种技术。两个专利申请案中都列举了测定遗传病，如镰状细胞贪血和β-地中海贪血症的方法的应用。这些方法和用于扩增核酸顺序的方法在《Science》第230卷。1350～1354页(1985)中，Saiki等著的文章中也揭示过。《Clin.Lab.Med》(1985)第五期。513～529页上Landry等写的综述文章中描述了核酸杂交领域用于病毒测定。WO86/01535(1986年3月13日公告)和欧洲专利173，529号(1986年3月5日公告)中都揭示3HTLVⅢ的分子的克隆和利用克隆作为探针测定艾滋病。更进一步地，欧洲专利公告173，339号(1986年3月5日公告)中，揭示了用DNA探针测定被外来微生物感染的遗传分析。欧洲专利185，444号(1986年6月25日公告)中，揭示了一种重组肽作为探针用于测定细胞溶解产物中的HTLVⅢ病毒。翁苏公司(Qncor Inc.)在1986年9月宣布它发展了一种放射血液试验测定艾滋病毒。用于测定肿瘤病毒HTLVⅠ和Ⅱ的杂交探针可能鉴定被持久感染，但不产生病毒的那些个人，也可能鉴定抗体阴性，但培养物阳性的个人，而且测定感染的细胞不需要培养病毒。用扩增法增加病毒的核酸的复制数将有利于鉴定在被感染个体中病毒的核酸。本专利技术包括一种测定或检验核酸顺序是否存在的方法，所述核酸顺序是指大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸的分离体中，或大量存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ核酸两者的分离体中，这种方法对于测定HTLVⅠ或HTLVⅡ的核酸或HTLV和HTLVⅡ两者分离体中的核酸是特别有效的，该方法包括(a).用核酸顺序的每条链的寡核苷酸引物、四种不同的核苷三磷酸和一种聚合作用剂在杂交条件下，一起或分别处理样品，对核苷顺序的每条链，合成每个引物的延长物，它是与每条核酸链互补的，其中所说的引物基本上与待测定或检验的核酸顺序的每一链互补，以每一个引物合成的延长物，当它从它的补体中分离时，可作为其他引物的延长产物合成的模板;(b).在变性条件下处理样品;(c).用寡核苷酸引物处理步骤(b)中的产物，将步骤(b)中所产生的单链作为模板合成引物延长产物，结果扩增了一个或多个特定核苷顺序，如果它或它们是存在的话;和(d).测定样品中的待测的顺序是否存在。测定产物的一种方法是向步骤(c)的产物中加入一种能与扩增的核酸顺序杂交的标记探针;并测定探针是否已经与核酸样品的扩增顺序杂交了。在一个具体实施例中，这样的测定可以以下列方式来进行(1).用一种可识别在探针中的核酸顺序中的某一位置的限制性内切酶消化杂交的混合物;和(2).测定限制性消化物是否有与HTLVⅠ或HTLVⅡ顺序的存在相关的限制性片断。在步骤(a)以前，病人样品中的核酸可能被抽出来，因此，待处理的样品实际上是一种抽提出的核酸的混合物。另外，步骤(a)中的待处理的样品不要预先进行这样的过程，即样品中的病毒是在培养。在另一个实施例中，本专利技术涉及了一种测定或检验核酸顺序是否存在的装置，所述的核酸是大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸分离体中，或大量存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ两者的分离体中的核酸，该装置对于HTLVⅠ或HTLVⅡ的核酸或HTLVⅠ和HTLVⅡ两者的分离体中核酸是有效的，核酸顺序被怀疑是包含在样品中，该装置包括(a).对于待测核酸顺序的每一条链，有一个寡核苷酸引物，一种或多种引物基本上是与每个特殊的核酸顺序的每条链互补，因此，从一种引物合成的一种延长产物，当延长产物从补体中分离出来时，可作为合成其它引物的延长产物的模板;和(b).一种能与核酸顺序杂交的标记探针。最好是，该装置也包含一种聚合作用剂，四种不同的核苷酯和一种用于测定探针和核酸顺序是否杂交的工具。这里的试验装置也可用于研究试验，临床试验和其他的诊断应用。另外，它也可以用于测定感染细胞而无需培养病毒，它在检查用于消除传染的各种治疗剂治疗病人也是有用的。本专利技术涉及测定或检验核酸顺序的一种方法和一种装置，所述核酸顺序与被怀疑含有该顺序的核酸样品中的HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒的任一种或两种是相关的。对HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒的分离体已被定好顺序。待扩增的顺序必定对HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒是特异的，即不与HTLVⅢ或其他的非HTLVⅠ或Ⅱ病毒起反应。HTLVⅠ病毒的完整基因组已为Seiki等在《Proc Natl Acad Sci》美国第80卷3618～3622页(1983)中描述过。HTLVⅡ病毒的完整基因组则由Shimotohno等在《Proc Natl Acad Sci》美国第82卷3101～3105(1985)中描述过。“大量存在于”一词应用于待本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定或检验核酸顺序是否存在的方法，所述核酸顺序大量存在于ＨＴＬＶⅠ或ＨＴＬＶⅡ核酸，或ＨＴＬＶⅠ和ＨＴＬＶⅡ两者的核酸分离体之中，特别适于ＨＴＬＶⅠ或ＨＴＬＶⅡ或ＨＴＬＶⅠ和ＨＴＬＶⅡ两者分离体中的核酸，其核酸顺序被怀疑是包含在样品中，其特征在于该方法包括：ａ、用核酸顺序的每一链的寡核苷酸引物、四种不同的核苷三磷酸、一种聚合作用剂在杂交的条件下，一起或分别处理样品，对于每一核酸顺序链，每一引物的延长产物被合成，它与要测定或检验的核酸顺序的每一链互补，这样，一种引物合成 的延长产物，当延长产物从它的补体中分离出来时，可作为合成其他引物的延长产物的模板；（ｂ）、在变性条件下处理样品以将引物延长产物从它们的模板中分离出来，如果待测的顺序是存在的；（ｃ）、用寡核苷酸引物处理步骤（ｂ）中的产物，将步骤（ｂ） 中所产生的每一条单链作为模板合成引物延长产物，如果扩增了要测定的顺序，如果它是存在的话；和（ｄ）、确定要测的顺序是否存在于样品之中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种测定或检验核酸顺序是否存在的方法，所述核酸顺序大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸，或HTLVⅠ和HTLVⅡ两者的核酸分离体之中，特别适于HTLVⅠ或HTLVⅡ或HTLVⅠ和HTLVⅡ两者分离体中的核酸，其核酸顺序被怀疑是包含在样品中，其特征在于该方法包括a、用核酸顺序的每一链的寡核苷酸引物、四种不同的核苷三磷酸、一种聚合作用剂在杂交的条件下，一起或分别处理样品，对于每一核酸顺序链，每一引物的延长产物被合成，它与要测定或检验的核酸顺序的每一链互补，这样，一种引物合成的延长产物，当延长产物从它的补体中分离出来时，可作为合成其他引物的延长产物的模板；(b)、在变性条件下处理样品以将引物延长产物从它们的模板中分离出来，如果待测的顺序是存在的；(c)、用寡核苷酸引物处理步骤(b)中的产物，将步骤(b)中所产生的每一条单链作为模板合成引物延长产物，结果扩增了要测定的顺序，如果它是存在的话；和(d)、确定要测的顺序是否存在于样品之中。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(d)包括如下几步(1)向步骤(c)的产物加入一个可与扩增的核酸顺序杂交的标记探针;和(2)确定探针是否已经与核酸样品中的扩增的顺序杂交。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(b)和(c)至少重复一次，而且引物是从HTLVⅠ和HTLVⅡ基因组中的X区中选出的。4.如权利要求1～3的任一权利要求所述的方法，其特征在于所述的聚合作用剂是从下列酶中选出的一种酶大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片断，反转录酶、或一种在暴露到足够使核酸变性的温度下仍保持其酶活性以在步骤(a)和(c)的反应温度下，形成所述的延长产物的酶。5.如权利要求1～4中任一权利要求所述的方法，其特征在于在步骤(a)之前，样品用可使样品中所含有的核酸链裸露的试剂处理，所述链可同时或随后分离。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)包括下列几步(1)用对探针顺序内某一位置有识别的限制性内切酶消化步骤(d)中的杂交了的混合物;和(2)确定限制消化物中是否含有与待测定的HTL...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰约瑟夫史宁史凯，雪利依瓦克，伯纳德波意兹，
申请(专利权)人：塞特斯公司，纽约州立大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]