利用酶标免疫检测法同时测定人体中的抗原和/或抗体制造技术

为了测定人生理体液中单结合对（在免疫学上成对的）的抗原和／或抗体的成员，本发明专利技术提供一种固相免疫检测法。本免疫检测法能够同时测定出受试样品中单结合对的抗原和／或抗体。因为在受试样品中可能有流动着的抗原和／或抗体。本检测法的特征是把结合对的适量抗原或增量加入到受试样品中，然后，在结合对固相吸收抗体存在的条件下温育受试样品。为了均匀分散受试样品中可能存在的抗原，最好在受试样品中先加入溶解液，然后再温育。（*该技术在2008年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供一种单一免疫检测法可以同时测出人体生理体液受试样品中单结合对的抗原和/或抗体。因为体液受试样品中可能含有正在流动着的抗原和/或抗体。本专利技术在优选实施方案中提供一种独特的酶标免疫检测法。利用该检测法可以在某一人的血浆或血清样品中，或在培养细胞的上清液中测定出HIV，HIV片断，HIV感染细胞和/或与HIV生物体相联的人抗体，或携带有HIV抗原的片断。实施本专利技术的免疫检测法，根据情况的不同，可以得出不同的试验结果，或者是抗体阳性，抗原阳性，或者是抗体、抗原“阴性”，尤其是在测定HIV抗原方面，与目前已有的方法相比，该专利技术则更精确，更敏感，结果较一致，并且所用时间也较短。HTLVⅢ感染，目前被称为HIV感染，通常引起艾滋病(AIDS)(获得性免疫缺陷综合症)。美国报导的艾滋病患者数量的不断增加已经使人们把艾滋病看成是近乎流行性疾病，且尚无有效的治疗方法，或疫苗。由于艾滋病是借助于性活动，滥用药物，移殖术过程中器官的污染以及输血进行传递的，因此，艾滋病事件首先在欧洲、非洲国家连续不断地出现。HIV的其它毒株，如HTLVⅣ由于病毒突变正在发展中。分别测定HIV抗体或HIV抗原的方法已被许多研究者，包括国家卫生协会(TheNationalInstituteofHealth)(NIH)的科学工作者发展起来。检验血浆和血清中HIV抗体的测定法已得到临床批准而商品化。大家知道，检验HIV抗原的测定法在研究使用中，但就我们所知，还没有一个得到临床批准并达到商品化。这些试验法分别独立地分析血浆，血清或筛选个体的血浆、血清或血细胞培养的上清液，来测定HIV抗原或者与HIV抗原相结合的人体抗HIV抗体的含量。近期的比较若干种试验方法的综述文章，请看抗HIV试验法筛选和确定试验，医学实验室产品，1987年4月，p16-18。通过性交，输血，或通过移植污染的器官或使用被滥用药物污染的针头，可感染HIV，受感染者的70-80%在4-6周内可以产生抗体。还有20-30%的受感染的个体，在长达6个月期间，不产生抵抗侵入病毒的抗体，他们是社会上保留的未检出的携带者。因此，如果说人们应该有效地筛选血液和器官的供给者，淘汰含有传播艾滋病的血液制品，那么就必须有筛选免疫检测法，它不仅能够检测HIV抗体而且能够检测出HIV病毒本身和/或被感染而携带病毒的细胞。目前，所遇到的困难是可能出现假阳性结果，或是由于非特异性抗体，或是由于抗体直接作用于支持细胞培养液中的正常细胞抗原。在支持细胞培养液中曾得到含有足够量病毒颗粒的上清液。因此，一般地说，必须克服现有检测法不够理想的敏感性问题。人们不了解有任何研究的或临术应用的免疫检测法可通过分析单一部分的生理体液受试样品能同时测出单结合对的两个成份，如抗HIV抗体，HIV生物体，或HIV感染的血细胞，如人血样品。实施本专利技术的检验法既可以成功地检测出病毒，病毒感染细胞，又可以检测出与HIV生物体联结的抗体。在一个器皿中，如在微滴板孔中即可进行此检验法。病人的受试样品最好是由人血浆(即一开始就除去所有细胞的全血)或血清(即除去所有凝血因子的血浆)组成。利用酶标免疫检测法(EIA)，可根据情况的不同得出“阳性”或“阴性”结果。利用本专利技术方法鉴定艾滋病感染病人的适宜性明显地高于目前所实施的方法。目前所实施的免疫测定法仅仅是跟踪生理样本如外周血中的抗HIV抗体。约4个小时，可得出测定结果。利用溶解病毒浓缩物释放出病毒蛋白，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使病毒蛋白，即抗原扩散开，这就是已知的Western吸印技术，只能用来确认抗HIV抗体存在而不能确认抗原存在。当病人已感染上HIV，但还没有出现抗体之前的一段时间内，该检测法实际上没有利用价值。同样，利用HIV溶菌产物作为固相蛋白，附着到固相支持物，如聚苯乙烯制成的微滴板上。这就是已知的ELISA技术，在受到HIV感局螅姑挥谐鱿挚固宓囊欢问奔淠冢缮秆〕隹乖荒苌秆笻IV抗体。还有一种方法，即在已知的适量HIV抗原存在的条件下，溶解样品中的HIV，使其与抗体包被的固相接触，然后在含有单结合对一个成员的生物素基化抗体存在的条件下温育受试样品，这一方法比较快，定量敏感，单个受试样品既可测定抗体，又可测定抗原。然而，这一方法尚未得到公认。为了测定人生理体液的受试样品如血浆、或血清，或细胞培养上清液中的单结合对的抗原和/或抗体，现在提供一种酶标免疫检验法。在本专利技术优选的实施方案中，免疫检验法被用来同时测定一个样品的HIV抗原和/或抗体。这里所用的方法是固相测定法，即酶联免疫吸附法(ELISA)。该法采用微滴板，微滴条，聚苯乙烯小珠或铁珠作为支持基。在特别优选的实施方案中，预定体积的如200μl的受试样品或标本，被引入到微滴板的一小孔中，该微滴板的小孔已经用纯化的抗HIV抗体所包被。该抗体是从具有适当高效价的人，山羊或其它哺乳动物血清或血浆制备的。如来自山羊的抗HIV抗体是通过常规的注射和采血程序，并利用纯化的HIV提供P24，GP120和GP160病毒蛋白或病毒糖蛋白而制得的。当得到足够效价的羊抗HIV抗体之后，回收和纯化抗HIV抗体。将样品进行温育，该温育程序采用挑选的发育试剂。检验程序中一个有意义的方面是包含有引导步骤，即把待测的单结合对抗原(事先选择好已知量，给定体积)加入到含有试验样品的已包被的小孔中。在测定的最后一步，已知量的抗原在事先选择的定量值水平上通常是可测的。如按设计对使用微微克浓度的抗原可测得一个光密度。光密度值不仅提供一条“基线”(试验结果阴性)，而且更重要的是在这一个检测样品中既可定量测定抗体阳性，又可定量测定抗原阳性，或测二者之一。本专利技术的一个有意义的方面是在进行试验的试剂盒中引入了或提供了无活性的或无传染性的病毒抗原，被称为“增量”(Spike)。如同将解释的那样，正是利用抗原增量，才能在一个小孔的待测样品中测出病毒抗原和抗体，或者是无。对于该专利技术来说，可将增量抗原理解为不是必需局限于由抗原位点组成，换句话说，从HIV外壳或膜上突出的增量实际上是由包括HIV核心蛋白在内的病毒蛋白混合物所组成。所选用的固相检测法是采用ELISA技术，通过测量可见反应物的光密度来显示免疫学反应。相对于各种病毒和含有抗体的生理体液和组织，关于采取各种方法显示免疫反应方面，应注意一系列综述性文章，题目是放射免疫检测法和饱和分析(RadioimmunoassayandSaturationAnalysis，BritishmedicalBulletin，Vol.30，No.1，Jan.1974)。该专利技术的抗体/抗原双重试验的功能，在其最广泛的意义上可以看作是受试样品中的特异抗体特异地与病毒抗原增量相结合的结果。如果免疫学反应检测或显示程序判定，某些或所有的已知量的病毒抗原正好与受试样品中的特异抗HIV抗体相结合，这样，少量抗原能从增量中监测出来，于是，试验结果则被解释成“抗体阳性”。另一方面，通过增量的形式，受试样品中的抗原右增加到已知的抗原量。如果检测程序表明，这是附加效应，试验结果则被解释为“抗原阳性”。然而，免疫反应所显示的试验结果，如光密度仅相当于通过增量加入的预先定量的微微克量抗原的光密度，那么，试验结果被解释为抗原抗体皆为阴性本文档来自技高网...

【技术保护点】
单一免疫检验法可以同时检测人的生理体液受试样品（可能含有循环的抗原）中单一结合对的抗原和／或抗体。该检测法包括：（ａ）使受试样品与固体表面接触，能够与对应的抗原决定簇（包含有上述单一结合对其它成员）相连接的抗体又可结合到固体表面上，并且 引入预先定量的已选好的上述抗原，为正常的阴性受试样品提供一个有用的可监测信号；（ｂ）温育反应生成物复合体并经历上述的结合信号而产生结合，此种结合能够产生与正常受试样品信号有关的可定量测定的信号，从而指出受试样品或者是抗原阳性，抗体阳性， 或者是上述的正常的阴性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：肯耐斯H克特里特，大卫E荷夫海恩茨，大卫米歇尔奥曼，夫曼迈里尔安，利松伊，斯玛里加保利特埃利茨勃，斯托诺凯蒂索，
申请(专利权)人：科特公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]