一种快速鉴别种子纯度的方法,它利用电泳技术制作被检种子的蛋白图谱,与标准种子的蛋白图谱比较后求得被检种子的纯度。由于采用了一定浓度一定pH值的Tris—乳酸缓冲液配胶,使其在电场中形成pH梯度胶,从而使蛋白图谱清晰、准确。其误差率较国标要求值提高了近3倍,时间由720-3000小时缩短为30小时,检测成本降低90%。(*该技术在2010年保护过期,可自由使用*)
【技术实现步骤摘要】
一种改进的、利用电泳法快速鉴别作物种子,特别是禾本科作物种子纯度的方法,属选种
随着现代种植技术的发展,人的对种子重要性的认识越来越高,种子的质量或者说高质量的种子纯度成为增产的关键。当前,鉴别禾本科作物种子纯度,例如玉米种子,一直采用形态法,即从待检种子的外观开始,直至种苗和全株长成,随访检查,借以判别是否纯种。这种方法有着难以克服的缺点一是形态特征不易掌握,用直觉去判断种子的纯度,易产生较大的误差;二是确定种子的纯度时间长,与生产严重脱节,鉴别一批种子一般需三个月左右,最快的也要十几天。且鉴定与生产同步进行,鉴定结论作出之时,即是作物长成定型之日,生米做成熟饭,无法弥补;三是浪费大量的人财物,而得到的数据准确度都很低。如何迅速准确地鉴定出作物种子的纯度,一直是国内外研究的课题。对此,国际上曾有人利用等电聚焦技术分析种子蛋白质的方法,去鉴别种子的纯度。其原理是两性载体(ampholion)在电场的作用下形成一个PH梯度,蛋白质分子运动到与其等电点相同的PH区段,就不再运动,这种方法分辨率较高,也比较准确,但两性载体价格昂贵,检测费用高。浙江大学、中国科学院遗传研究所提出利用同工酶电泳技术鉴别种子纯度,但这种方法要求待检种子必须都能发芽,若是死种子,酶就丧失了活力,电泳后也就无法判定种子的归属。中国科学院植物研究所利用电泳技术分析玉米种子的纯度,采用未脱脂的玉米粉,用尿素提取蛋白,凝胶先进行予电泳而后加样。这种方法较为简单易行,但存在以下问题一是蛋白质在电泳过程中易产生沉淀;二是电泳分辨率不高;三是有些蛋白质同脂肪结合在一起,对蛋白质迁移率有影响,常发生拖带现象,使蛋白图谱不清晰。本专利技术的目的在于提供一种利用电泳技术,迅速准确地鉴定作物种子纯度的简便实用方法。它应具备较低的检测成本,而又能获得清晰的蛋白图谱。除此之外,本专利技术还应解决蛋白质的沉淀和蛋白图谱中的拖带现象。本专利技术的目的是这样实现的利用电泳技术,以一定浓度一定PH值的Tris-乳酸缓冲液配胶,使其在电场中形成PH梯度胶,使待测种子蛋白质分子在电场作用下迁移至与其等电点一致的PH区段,并一直聚焦在那里,当蛋白质分子分离完后,再按传统的方法染色照相,即可获得清晰的蛋白图谱。然后,将待测种子蛋白图谱与标准蛋白图谱相比较,即可求得被测种子的纯度。以下结合实施例对本专利技术作进一步详述。本专利技术的关键是寻找一种电泳检测所需要的低成本高效率的PH梯度胶,即制作出合适的分离胶(包括重胶液和轻胶液)和成层胶。中国科学院植物所采用的分离胶的成份是(以总体积20ml为例,下同)重胶液(20%)轻胶液(10%)30%丙烯酰胺8.0ml30%丙烯酰胺40ml乳酸钙0.2g乳酸钙0.2gTEMED20-30μlTEMED15-25μl10%APS30-50μl10%APS40-60μl水4.0ml水8.0ml成层胶的成份是(5%)30%丙烯酰胺1.0ml乳酸钙0.1gTEMED30μl10%APS40-60μl水5.0ml其中TEMED是指NN,N′N′-四甲基乙二铵,APS是指过硫酸铵。本专利技术所用分离胶是在上述组份基础上,加入Tris-乳酸(Tris是指三羟甲基氨基甲烷)和尿素,各组份含量为重胶液(15-25%)轻胶液(10-15%)Tris-乳酸1.7-5ml尿素0.5-4g0.5-4g30%丙烯酰胺5-8.3ml3.3-5ml水5-6.7ml乳酸钙0.05-0.15g0.05-0.15gTEMED25-40μl15-40μl10%APS30-60μl30-60μl本专利技术所用成层胶(3.5-7%)是在原成胶的基础上,加入尿素而成,其组份含量为尿素0.5-1g30%丙烯酰胺0.5-1ml水3.2-3.7ml乳酸钙0.05-0.1gTEMED20μl10%APS30μl由于在胶中加入了尿素,增加了蛋白质的溶解度,从而克服了电泳过程中的沉淀现象。为了防止在蛋白图谱中出现拖带现象,增加清晰度,在制备被检样品时首先要对种子进行脱脂,脱脂溶剂可采用丙酮、乙醚等。以下给出本专利技术所用分离胶和成层胶的几个实施例1、重胶液单各浓度中的含量组份名称位18%21%24%Tris-乳酸ml4.33.11.9尿素g11.5330%丙烯酰胺ml5.76.98.1乳酸钙g0.10.150.15TEMEDμl30303010%APSμl5050502、轻胶液单各浓度中的含量组份名称位10%12%15%尿素g11.63.430%丙烯酰胺ml3.344.8水ml6.765.2乳酸钙g0.10.150.13TEMEDμl30303010%APSμl5050503、成层胶单各浓度中的含量组份名称位4%5%7%30%丙烯酰胺ml0.560.70.98乳酸钙g0.040.060.1水mL3.63.53.2尿素g0.40.70.96TEMEDμl20202010%APSμl303030制备被检种子蛋白图谱的操作步骤如下1、制备样液将被检种子粉碎,用丙酮进行脱脂,然后将脱脂后的玉米粉加入1M的尿素充分振荡、离心后,制得蛋白样液。2、准备胶室按常规方法制备好胶室,底部琼脂浓度为1%,高度为3厘米左右。3、灌胶按配方将重胶液、轻胶液及成层胶配好。将轻胶液倒入梯度混合仪内远离导管的筒内,打开阀门,让轻胶液充满两筒之间的通道,关闭阀门,把重胶液倒入另一筒。将梯度混合仪放在磁力搅拌器上,开启电源搅拌。将导管插入胶室,调整胶液的流速,并迅速打开开关注胶。待胶液离凹玻璃上口3厘米时,停止灌胶并在胶液上注入一薄层水,待胶聚合后,抽出复盖水,注入成层胶,并插入“梳子”,制出符合要求的样品槽。尔后将胶室转移到电泳槽上,用琼脂将玻璃板与电泳槽有机板之间的间隙封好。4、加样用微量进样器吸取30-40μl的样液,加入样品槽,再加一些0.1M乳酸溶液,然后用琼脂将样品槽密封。5、电泳在上电极室加入0.1M的乳酸溶液,下电极加入Tris-乳酸缓冲液,上电极为正极,下电极为负极,接通电源。在上电极室胶的正上方上加入甲基绿指示剂,待甲基绿到达底部时,即可收电泳。6、制备蛋白图谱将电泳后的凝胶取出,切除成层胶及琼脂,将分离胶移入染色盘内,倒入染色液染色,染毕后用脱色剂脱色,直至背景无色为止,即可得到被检干种子蛋白的电泳区带图谱。如需要,图谱可照象留挡。将被检种子蛋白的图谱与标准种子蛋白图谱相比较,即可求得被检种子的纯度。用本专利技术做玉米种子纯度鉴定,所得图谱清晰,没有沉淀和拖带现象,分辨率明显提高,图谱中的蛋白谱带数增多。例如中单2号玉米种子的谱带由原来的9条(指采用中国科学院植物所所用方法制得的蛋白图谱中的谱带数,下同)增至18条;丹玉13号玉米种子的谱带由原来的7条增至15条等等。由于谱带增加,使检测的结果更为准确。经计算,其平均误差为0.34%,与形态法相比较,其准确度是形态法三叶期的21倍,花期的25倍,全生育成株的3倍。同GB3543-83国际中允许的误差相比,准确度也提高近3倍。另外,用本专利技术鉴定种子纯度非常迅速,时间仅需30小时,而形态法则需720-3000小时。由于检测迅速,使农民完全可以在播种前检测完毕,且准确度高,避免了劣种、假种所带来的经济损失。检测费用低,与采用两性载体的等电聚焦法相比,成本降低了近90%。本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速鉴别种子纯度的方法,它利用电泳技术,将被检种子粉碎,制备蛋白质样液,加入胶室内,进行电泳、染色及脱色等操作后,制得其蛋白图谱,而后与标准种子的蛋白图谱相比较,求得被检种子的纯度,电泳胶室所用的分离胶由重胶液及轻胶液在梯度混合仪上 混配而成,其中,重胶液由丙烯酰胺、乳酸钙、N、N、N'、N'-四甲基乙二胺、过硫酸铵及水组成,轻胶液由丙烯酰胺、乳酸钙、N、N、N'、N'-四甲基乙二胺、过硫酸铵和水组成,成层胶由丙烯酰胺、乳酸钙、NN、N'N'-四甲基乙二胺、过硫酸胺及水组成,其特征在于:在分离胶中加入尿素和三羟甲基氨基甲烷乳酸缓冲液,在成层胶中加入尿素,各组份含量为:a、重胶液(15-25%)(以20ml总量计,下同):三羟甲基氨基甲烷-乳酸,1.7-5ml尿素,0.5-4g乳酸钙,0.0 5-0.15gNN,N'N'-四甲基乙二胺,15-40μl30%丙烯酰胺,5-8.3ml10%过硫酸铵,30-60μlb、轻胶液(10-15%):尿素,0.5-4g30%丙烯酰胺,3.3-5ml水,5-6.7ml 乳酸钙,0.05-0.15NN,N'N'-四甲基乙二胺,15-40μl10%过硫酸铵,30-60μlc、成层胶尿素,0.5-1g30%丙烯酰铵,0.5-1ml水,3.2-3.6ml乳酸钙,0.05-0.1g NN,N'N'-四甲基乙二铵,20μl10%过硫酸铵,30μl。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:牛战旗,尚颖,
申请(专利权)人:河北省农产商品质量监督检验站,
类型:发明
国别省市:13[中国|河北]
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