测量细胞活化的酶测定及测定盒制造技术

一种检测细胞（包括淋巴细胞）的应答或活化的测定方法，以及检测患者免疫感受性的方法，包括引入一种细胞活化物质，该物质能使细胞的一种酶有效地反应，以及利用能产生可检测产物的底物测量酶促反应，以及进行该测定分析的测定盒。（*该技术在2010年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于免疫学、细胞生物学和药学领域，本专利技术涉及酶的测定以及借助于细胞活化物质(如与淋巴细胞特异性反应的抗原)测量细胞活化，尤其是血细胞如淋巴细胞活化的测定盒。测量特异性免疫应答或免疫系统的一般反应性是诊断和研究许多重要疾病的有用工具。最初，这种试验仅限于体内技术如进行皮试以测定即时的或延迟的过敏性存在。自1960年以来，已进行了许多体外测定，这些测定可看作是与体内免疫应答相关的。这些生物测定中多数是依据这样的事实，即免疫系统细胞(称为淋巴细胞)识别它们应答的化学结构，如对它们具有特异性的一种抗原。作为这种应答反应的一部分，淋巴细胞被活化，扩增成为“坏细胞”、分裂和/或分化。因此，在有合适的激发抗原存在时，体外测量淋巴细胞芽生或淋巴细胞增殖已可用于测量特异性免疫应答，主要是T淋巴细胞系的应答。由多克隆活化剂在大多数淋巴细胞中诱导的同样反应已使医生和调查研究者能估测淋巴细胞群的一般反应，这种多克隆活化剂刺激整个淋巴细胞类(而不仅是特异性抗原群)。各种物质，如来自植物的促细胞分裂的植物血凝素(如刀豆球蛋白A、植物血球凝集素、美洲商陆有丝分裂原)。细菌产物(如脂多糖、细胞壁物质、肠毒素)和各种化学试剂或生化试剂(如佛波醇酯、高碘酸钠、半乳糖氧化酶、硫酸葡聚糖)能诱导多克隆活化作用。(见，Roitt，I.等人，IMMUNOLOGY，C.V.Mosby Co.(1985))。近来研究表明，体外分析淋巴细胞活化作用或刺激作用需要测量细胞生长(如增殖)，测量细胞生长是通过将DNA的放射性前体(最典型的是3H-胸腺嘧啶或125I-脱氧尿嘧啶)掺入到正增殖的细胞中进行的。这些测定技术要求，需要无菌的细胞培养条件和多级分馏的血样，从而使这些测定分析成本比较昂贵。另外，这些分析试验产生放射性废弃物，这在美国是日趋严重的问题。最重要的是，这种测定方法通常需要3-7天，并且结果十分不确定，尤其是当应答之间(例如，在一个病人和一个作对照的健康人之间)的差异是有限的(虽然有意义)，而不是“全有或全无”时更是如此。再者，为测定对一连串刺激的应答，现有的测定方法需要较大量的淋巴细胞，从而在测定淋巴细胞减少或白细胞减少患者(如化疗、骨髓移植后，或免疫缺陷症如AIDS)时，这就成了难题。因此，快速、简便、需要少量血液/样本并且避免使用放射性同位素的测定淋巴细胞活化的方法有重要价值。对于临床实验，下面的测定是重要的(1)容易成为常规化，需要尽可能少的处理细胞;(2)自动化，和(3)比现有的细胞增殖测定方法更能提供具有再现性的结果。一种更快速测定方法是测定在开始刺激细胞活化之后的较早时间内，即在DNA合成和细胞增殖之前出现的情况。胞内酶或与膜有关的酶的“活化”是由一个信号(如与特异性淋巴细胞相关联的一种抗原)激发细胞膜后早期出现的一种类型的情况(Sell，S.，Immunology，Immunopathology and Immunity，Elsevier，1987)。利用具生色团底物或其他物理学方法可检测的反应物或产物的酶-底物反应很容易监测上述酶的活化或有效的应答。Landegren，U.(J.Immunol.Meth.67379-388(1984))利用了一种普遍存在的溶酶体酶，氨基己糖酶，并进行测定以定量每个微滴板井眼中存在的细胞数目。利用该酶的一种生色团底物，对-硝基苯酚-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，产生一种显色反应产物，利用比色板读数器测量该产物在405nm处的收光度(A405)。将底物加至细胞培养物中，在给定的反应时间内产生的颜色(即形成的反应产物)的量与细胞数目成正比。利用这种方法可测量应答生长因子的淋巴细胞的增殖，细胞对表面的吸附，以及细胞对抗体所覆盖平板的吸附。因此在可能提供一种有效的放射性同位素的替代物用于测定淋巴细胞增殖的同时，在该文献中介绍的这种方法在测量早期淋巴细胞活化时是没有价值的，因为这种酶明显具有活性并且在所有时间内对底物是有效的。另一个问题是，由于该酶存在于血清中，在体外培养以前，需要彻底清洗血细胞以除去含酶的血清。Alcina，A.等人(J.Immunol.Meth.1051-8(1987))修改了Landegren描述的方法(见上文)以检测细胞内寄生物的存活力和死亡。Mosmann，T.(J.Immunol Meth.6555-63(1983))利用四唑盐MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)进行了同样的测定分析，该四唑盐经线粒体脱氢酶修饰形成一兰色甲 (formazan)产物，可以在570nm处通过分光光度法测量该产物的吸光度。细胞数目在某一范围时，该底物可使细胞数目和产生的颜色之间形成线性关系。该方法已用于测量生色因子对几种淋巴细胞系生长的刺激作用。另有人修改了Mosmann的方法，以测量细胞毒性分析中存活的细胞(Green L.M.等人，J.Immunol.Meth.70257-268(1984))。已知的碱性磷酸酶是与各种正常的和白血病的淋巴细胞类型的分泌和吸收表面相关的酶(Neumann，H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA731432(1976);Culvenor，J.G.等人，J.Immunol.1261974(1981))。利用对-硝基苯磷酸盐作为底物，Garcia-Rozas，C.等人(J.Immunol.12952-55(1982))分析了用各种有丝分裂原体外培养的鼠淋巴细胞的碱性磷酸酶。在分析前，将细胞用戊二醛固定并且用清洁剂处理，然后加入底物，用一个平板读数器直接在平板上(A405)读出颜色反应。发现碱性磷酸酶尤其与B淋巴细胞相关。用脂多糖(LPS)或美洲商陆有丝分裂原(PWM)“激活”三天的B细胞中酶活性有效地提高，并且与扩增的“坯细胞”相关。Hashimoto，N.等人(J.Immunol.Meth.9097-103(1986))修改了Garcia-Rozas等人的分析方法(上文)，即将存在于清洁剂中的底物直接加入含有受刺激B细胞的微滴板井眼中(在细胞洗涤一次后)。利用该分析方法可测量用LPS刺激3天并且用T细胞产生的因子进一步刺激1-2天后的B细胞增殖。与测量3H-胸腺嘧啶摄取相反，该分析方法的优点在于，它甚至能够在大量“污染”T细胞存在时选择性地检测B细胞增殖，并且能够测量HAT培养基(通常用于选择杂交瘤)中的细胞。没有证据表明在3天前出现酶的活化，并且新鲜B细胞可检测酶活性的界限是需要105或更多的细胞。EPO 0166505(1985年1月2日公开)提供了一种通过色谱分离和比色分析法定量检测碱性磷酸酶的方法，其中当酶活性为2×10-6单位时出现一个可检测信号。但是，在该申请中公开的测定系统和测定盒是设计用于部分纯化的酶，而不是完整的细胞。Chan，K-M.等人(Anal Biochem.157375-380(1986))描述了一种直接比色分析法，该方法用于测量脂细胞浆膜制剂或肝微粒体中Ca2+刺激的ATPase活性。该测定方法基于一种生色反应与ATP底物产生的Pi产物偶合而进行。酶只有在细胞提取物中测量，并且没有暗示用于测量完整细胞。EPO 0122028(1984年10月17日本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测完整细胞活化的方法，包括：ａ）在适当的间隔内，将所述细胞与一种细胞活化物质接触，其中所述的细胞活化物质能使该细胞的一种酶有效地进行反应；ｂ）提供一种能与所述酶反应的酶底物，该酶在所述完整细胞内或细胞表面；和ｃ）通过测量所 述酶一底物反应的产物而检测细胞的活化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉塞尔M贾非，
申请(专利权)人：拉塞尔M贾非，
类型：发明
国别省市：US[美国]