异硫代伏杀磷的免疫测定法制造技术

本发明专利技术公开了以可与异硫代伏杀磷（尤其是５－氯－２－甲基－３－异硫代伏杀磷）反应的单克隆抗体为基础的免疫测定法，产生这样抗体（特别是ＡＴＣＣ ＳＤ１４２５）的杂化物，制备可与异硫代伏杀磷与大分子载体免疫原结合物的方法；制备可与异硫代伏杀磷反应的单克隆抗体的方法；以及一些可与异硫代伏杀磷反应的单克隆抗体和多克隆抗体的组合物。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用免疫测定法检测低浓度的异硫代伏杀磷类化合物。异硫代伏杀磷类化合物在许多存在水和湿气的应用场合广泛地用作生物杀伤剂。在这些应用的许多场合需要测定该系统中异硫代伏杀磷的正确的剂量的稳定性。该
目前的情况是使用高压液相色谱分析法，但这种方法费时、繁琐并且价格昂贵。1988年3月23日公开的西屋电气公司(WestinghouseElectricCoyporation)的欧洲专利申请(申请号为0260829专利技术人是KEennethW.Hanter)公开了可同氯化酚类(尤其是五氯苯酚)反应的单克隆抗体以及产生这些抗体的杂交瘤。还公开了用于检测这些氯化酚类的免疫测定法。虽然许多化合物的检测方法大大地得益于免疫测定法，但是合适的细胞系却很难产生。美国专利4865972(Hunter)公开了一种以抗体为基础的测定酶诱导化合物的方法。异硫代伏杀磷不是酶诱导化合物。Kohler和MILSTEIN在Nature265;495(1975)中最先描述了针对绵羊红细胞的单克隆抗体是如何通过用肿瘤细胞融合可产生B-淋巴细胞的特定抗体以导致“永生的”自制杂交克隆(或杂交瘤)形成，这种杂交克隆可以在细胞培养物中(试管中)或动物身上(在体内)合成单个的单克隆抗体。本专利技术的目的是提出一种经过改进的检测异硫代伏杀磷化合物的方法。本专利技术的另一目的是培育一种用于检测异硫代伏杀磷的免疫测定法的细胞系。这些目的以及从以下公开内容显示出的其他的目的是通过本专利技术实现的。本专利技术一方面包括一个新的细胞系，该细胞系能产生可与3-异硫代伏杀磷(尤其是5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷)反应的单克隆抗体。本专利技术还涉及到可和这些异硫代伏杀磷反应的单克隆抗体和多克隆抗体。本专利技术涉及抗体、制备这些抗体的方法、分析、论断、监测、分离，以及使用这些抗体的其它方法，以及含有用作这种用途的这些抗体的组合物。此外，本专利技术还涉及可产生单克隆抗体的杂化物以及制备这些杂交瘤的方法。最后，本专利技术还涉及异硫代伏杀磷和大分子载体的免疫原结合物以及制备这些结合物的方法。附图说明图1表示根据本专利技术的免疫测定法的异硫代伏杀磷的四个不同种类的结合的抑制百分比。异硫代伏杀磷作为一个类别是具有1.053×103mol/秒的与硫醇反应的一级速度常数的强反应亲电试剂(见P.J.cllie等人在J.Appl Bacteriol;69;578-584，1991的文章)。5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷还具有在同硫醇类发生开环反应后进一步反应的能力。已知血清和红细胞中含有大量的谷光甘肽(一种被还原的硫醇化合物)。紧接在异硫代伏杀磷被加到牛血清之后无论是用生物测定法、紫外分光光度法或高效液色谱法(Proclin 300 product bulletin，Rehm and Haas Company，Philadelphia，PA)都不能检测出异硫代伏杀磷，这意味着异硫代伏杀磷和亲核试剂发生反应并且破坏了完整的环结构。这种用实验说明过的异硫代伏杀磷同血清中已知存在的亲核试剂的快速反应引导人们推测;为了诱导抗体的形成而被注入动物体内的完整的异硫代伏杀磷并不能存活足够长的时间以便和免疫系统的适当组分发生相互作用。因此，完全不能指望可诱导出针对异硫代伏杀磷的抗体。我们业已发现了一些可以满足许多现有分析技术所不能满足的苛刻要求的新颖的抗体。这样的抗体使得我们可以用各种快速的、简单的、价格合理的免疫测定技术检测生物杀伤剂。这些新颖的抗体用于分析水中的异硫代伏杀磷化合物尤为有效，因为所述异硫代伏杀磷不必被萃取出来。可以使用多克隆抗体，但使用单克隆抗体更为可取。单克隆抗体是从使得它们具有非常强的特异性和均匀性的B-淋巴细胞无性繁育系(“杂交瘤”)中衍生出来的。这样的杂交瘤实际上是一种自身复制的“工厂”，能潜在地无限地供给单个的、被预先限定了特异性的抗体。虽然本专利技术的单克隆抗体的产生是针对5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷(“651”)，但它也可以和其他异硫代伏杀磷类(例如2-甲基-3-异硫代伏杀磷(“573”)、4，5-二氯-2-n-辛基-3-异硫代伏杀磷(“287”)和2-n-辛基-3-异硫代伏杀磷(“893”)发生交叉反应，如图1所示那样。用于本专利技术的异硫代伏杀磷具有如下分子式; 其中R1和R2各自选自氢、卤素或(C1-C4)烷基，或者可以相互连接形成饱和的、不饱和的或芳香的5节或6节稠合碳环;Y是氢、未被取代的或被卤素取代的(C1-C18)烷基，未被取代的或被卤素取代的2至8个碳的链烯基或炔基，未被取代的或被卤素取代的(C3-C8)环烷基，芳烷基或被卤素取代的、被(C1-C4)烷基取代的或被(C1-C4)烷氧基取代的最多可达10个碳原子的芳烷基或芳香基或被卤素取代的、被(C1-C4)烷基取代的，或被(C1-C4)烷氧基取代的最多可达10个碳原子的芳香基。典型的Y取代基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、己基、辛基、环己基、4-甲氧苯基、4-氯苯基、3，4-二氯苯基、苯基、4-甲基苄基、4-氯苄基、苯乙基、4-苯基丁基、氯甲基、氯丙基、氢以及类似基。制备单克隆抗体可采用以下方式产生一种异硫代伏杀磷和大分子载体的免疫原结合物，用这种结合物使动物免疫，以便从该动物体内得到抗体生成细胞，用肿瘤细胞融合这些细胞以生成杂交瘤，从这些杂交瘤中选择出至少一种可产生与异硫代伏杀磷反应的抗体的杂交瘤并且从所选择的杂化物中回收生成的抗体。在体内产生可和异硫代伏杀磷反应的单克隆抗体的方法涉及到将一个可产生这些抗体的杂交瘤通过腹膜注入组织相容的或受到免疫抑制的宿主中并从该宿主的腹水中回收生成的抗体。一个可产生针对异硫代杀磷的单克隆抗体的传代细胞系按以下方式制备产生一种异硫代杀磷的免疫原结合物，用该结合物使动物免疫，以便从该动物体内取得抗体生成细胞，用肿瘤细胞融合抗体生成细胞以产生杂交瘤，从中选择出一种可产生能与异硫代伏杀磷反应的抗体的杂化物并且以无性繁殖方式将所选择的杂交瘤扩大成一个细胞系。所研制出的用于651的传代细胞系被称作“抗-651”抗体。为了检测样品中是否存在硫代伏杀磷或检测其浓度，将可与异硫代杀磷反应的单克隆抗体加到样品中并通过免疫测定法检测是否存在异硫代伏杀磷或检测其浓度，在该方法中，单克隆抗体用作试剂。在可接受的载体内最好加有单克隆抗体。抗-651抗体可用标准操作方法耦联到酶辣根过氧化酶(“HRP”)。这个被耦联的酶-抗体可以用作测定诸如木材、皮革和塑料这些固体基质中所存在的异硫代伏杀磷的着色剂。将准备检测的基质用适当的方法切成薄片，然后和被耦联的酶-抗体一起保温一段时间，在此期间同异硫代伏杀磷或异硫代伏杀磷类反应。保温后，将未结合的酶-抗体用缓冲液(例如PBS-Tween)洗涤除去。接下去被处理的基质材料和酶底物一起保温，市售的许多生色化合物都可以用作酶底物。基质用一定容量的底物加以处理，底物容量的多少以使有色产物不从反应位置上扩散光为准。另一方面，底物可被加到覆盖在被处理过的底物上的膜上。这样一种产品的例子是出自国际生化公司(“IBZ”)的EnzygraphicWeb。通过对所述基质或被底物渗透的膜的目测或显微镜观测，将所述异硫代伏杀磷限制在一定区域。使用酶耦联抗体的替代方式是使用铁蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备异硫代伏杀磷和大分子载体的免疫原结合物的方法，该方法包括：将一个化学链以共价键方式结合到大分子载体上，将含有反应基的异硫代伏杀磷衍生物以共价键方式结合到该化学链上。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：GL威林哈姆，RF舒曼，CH黄，JS查普曼，
申请(专利权)人：罗姆和哈斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]