一种基于微粒光散射的免疫分析方法技术

一种同时测定一个流体样品里一种或多种抗体，抗原或半抗原被分析物的均质免疫分析方法，包括定量分析上述被分析物对光散射脉冲高度分布直方图统计性变化的影响。该直方图变化是由较大直径的单分散性结合分子包被的多聚微球体被较小直径的多分散性结合分子包被的胶态金属微粒所结合后产生的。为同时分析多重被分析物，给每种被分析物分配不同直径或折射率的微球体，此分析方法可用于正向结合、替换、抑制、竞争类型的系统里，由取决于系统的直方图线度变化来指导完成。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术主要涉及在流体样品中测量一种抗原、抗体或半抗原被分析物的均质免疫分析方法，是通过测量流动微粒分析仪里单分散性微粒发出的光散射信号来实现的。尤其特殊的是该专利技术涉及测量光散射信号的变化，这种光散射信号来自结合分子包被的单分散性多聚微球体，这是结合分子包被的多分散性胶态金属微粒的这些微球体与被分析物中间结合的结果。抗体、抗原和许多半抗原呈现高亲合力，这不仅对它们的互补蛋白，而且对某些固态表面，例如塑料微量滴定平板的小孔、塑料试管壁、多聚微球体和胶态金属微粒的表面也是如此。这些特性的开发引出了诊断分析方法领域的一场革命，这些分析方法用于分析上面所述的象血清这样流体样品中的被分析物。在固态支持物上进行抗原抗体相互作用的能力已极大地简化了从未使用的反应物及干扰物质中分离出包含被分析物的免疫复合体的步骤。生物流体样品中常存在这样一些干扰物。这些系统通常被称作“固相免疫分析”或“免疫吸附剂分析”，属于“异质性免疫分析”。异质免疫分析中的相分离步骤在减少非特异性结合物质的干扰方面很有价值，这些物质通常对分析方法的灵敏性有不利影响，这些分析麻烦且昂贵，而且是自动化系统中可靠性问题的焦点。另外，这些异质性系统还有一个缺点，即要求免疫复合体的一部分或另一部分被一种易于定量的分子标记。这些分子通常被称作“报告分子”，包括放射性同位素(放射免疫测定，RIA)，酶类(通常伴有生色团的酶联免疫测定，ELISA)，荧光分子(荧光免疫分析，FIA，)，化学发光分子(CIA)，金颗粒，光敏分子等等。作为回顾，可参考Kemeny，D.M.，etal.，ImmunologyToday，767(1986)。更进一步来说，因为作为受体分子的生色团和荧光团的数目有限，且这些分子的发射谱大量重叠，所以不适于用这些报告分子进行多重被分析物的同时分析。例如，CambridgeBiotech.的对C.difficileToxinA和ToxinB，HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ，HIV-1和HIV-2进行的同时性EIA分析就是不可分的。本专利技术大大地简化了从单个反应混合物中多重被分析物中信号的可分离性。“均质免疫分析”这个术语用于没有相分离的免疫分析。这些系统包括结合蛋白包被的微粒凝集分析，由于它们在实现自动化时需要较少的步骤，而且自动化在机械、流动性、电子方面都简单，故很有用。无需相分离步骤的免疫分析的例子如下胶乳微球体凝集、血细胞凝集和荧光消偏分析。对于单种被分析物的胶乳珠凝集分析的例子可在专利号为4521521，4184849，4279617，4191739和4851329的美国专利上找到，对于单个液态样品中多重被分析物的分析之例可在Hansen的待批准的美国专利申请(申请号为883574)上找到。用于凝集或荧光消偏分析的散射浊度或比浊测定自动系统简单且建造费用便宜，与异质分析不同的是，它不需要频繁地保养复杂的相分离装置。然而，从另一方面讲，由于体液里干扰物质的存在，均质免疫分析这一方法不能满足许多重要医学检测的高灵敏度要求，如不能满足酶联免疫分析(ELISA)和放射性免疫分析(RIA)的要求。对这个问题的回顾可以看看例如Masson et al.，Methods in Enzvmology，74115(1981)和Collett-Casssart et al.，Clin Chem.，2764(1981)。本专利技术的一个重要方面是它是一种不受非特异性干扰的物质免疫分析方法，灵敏度至少可达5×10-13M。这种灵敏度水平比原来的均质胶乳珠凝集分析技术要高2-3个数量级。看看几个例子α-胎儿球蛋白(3×10-10M，以上提到的Collett-Cassart等)，尿内人绒毛膜促性腺激素(HCG)(6×10-11M，Lentrichia et al，.J.Immunol.Meth.，89657(1986)(但是在被分析物水平二十倍于所标灵敏度极限时，只与放射免疫测定(RIA)表现出87%的相关性)，荧光消偏方法测定的血清地高辛(digoxin)(3×10-10M，S.Wong in D.Chan，ed.，Immunoassay Automation，Academic Press，1992，P.329)。以前为消除或减少非特异性干扰物对均质免疫分析的不利影响所作的技术方法已普遍不能令人满意。这些方法包括体液样品的高倍率稀释(Fritzetal.，J.Immunol.，108110(1972))，但是这样会等比例地减小灵敏度;使用抗体片段(Masson，Id.)，但这种方法昂贵且不可靠;使用特殊的PH、离子强度和缓冲液类型等条件，和(或)加入螯合物或其它净化剂(Masson，Id.)，但是这样会引入多重依赖因子，对每一种被分析物这些因子都必须选择成最佳的，这就使得分析过程极其昂贵和麻烦(Limetal，.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.，20141(1982))。解决非特异性干扰这一难题还有其它方法，其中包括使用IgG包被的胶乳超微球体来抑制分析过程中的非特异性反应，该分析过程是使用了抗体片段的胶乳球体凝集分析。据报告，这样一种使用了具有30μm小孔的Coulter原理电阻流动颗粒分析仪的凝集方法的灵敏度约为5×10-13到4×10-12M(Sakai et al.，Chem.Pharm.Bull.，373010(1989))。这种方法的弱点在于附加反应物(非特异性的、IgG包被的超微球体)会不断增加制造、质量监督以及贮存的费用。本专利技术可以消除这一重要弱点，它通过在所有一种反应物中把特异性免疫反应作用和提高特异性的作用相结合来实现的。另外，虽然Sakai等使用的库氏(Coulter Principle)微粒计数器产生定量结果，但是在检测凝集时需要用到小孔(30μm)，这就产生了一个众所周知的问题，即凝集反应时的堵塞现象(Masson，Id.)。本专利技术使用的鞘管式流动微粒分析仪有250-300μm的小孔，消除了堵塞现象。这样一来，在Sakai等人的方法中，如果试图同时分析一种以上的被分析物，则特异性凝集微粒(二聚体、三聚体等)的分布就会产生一个问题-库氏(Coulter)体积重叠，而在本专利技术中却不存在这一问题，因为多聚体不会形成，而且能够进行多重同时性分析而不需要为消除重叠问题作数学运算。原凝集免疫分析遇到的另一个问题是，在含有一微米或以上微粒的反应混合物完全反应期间，需要用机械搅拌器进行搅动(masson，Id.)，这就要求样品之间的严苛洗涤以防止样品互相遮盖。本专利技术进一步的优势在于目前就自动化方面来看，在有效时段内完成凝集反应而不需要进行样品的搅拌。Schutt等人的欧洲专利0254430和美国专利5017009记载了对一种被分析物的散射全内反射(STIR)分析方法，该方法中使用胶态金颗粒来标记结合在涂覆的有光学特性的可见塑料平板上的蛋白质。这种免疫分析依靠的是对一种由瞬时波的扰动所散射回来的光的测量，该波由在免疫反应中被带到分界面处的胶态金标记物引起。这种瞬时被认为是入射光波全内反射的结果，这一测量方法的缺点是昂贵的光学特性塑料平板不能重复使用，而且用过一次就必须丢弃。对于在流体样品中的抗原、抗体、半抗原的免疫分析方法还本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于光散射的多聚微粒免疫分析方法，用于在基本上没有所述的多聚微粒自聚集情况下在一单独流体样品里同时测定一种或一种以上的抗体、抗原或半抗原被分析物，该方法由以下步骤组成：ａ）为每一种所述被分析物选择有独特直径或折射率的第一结合分子包被 的单分散性多聚微球体，这样可以从所有其它具有独特直径微球体直方图中分辨出对于每一类所说的具有独特直径或折射率的微球体的光散射脉冲高度分布直方图，该图从光学鞘管式流动微粒分析仪获得；ｂ）一台光学鞘管式流动微粒分析仪上装备了一个用于产生窄反 应混合物液流的可调节装置，一个用于将流过光学毛细鞘管式流管的所述窄流集中到中心的可调节装置，一个入射光源，以及一个测量由所说微球体引起的所说入射光散射的装置，在该光学鞘管式流动微粒分析仪中测量每一种所说的被分析物对第一结合分子包被的单分散多聚微球体光散射脉冲高度分布直方图统计性变化的影响，所述微球体通过与第二结合分子包被的多分散性胶态金属微粒相结合而被引发；和ｃ）将所述被分析物的效应与单个液体样品里每一所述被分析物的量相关连起来。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：WP汉森，M仙纳拉佐，
申请(专利权)人：西恩纳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]