己糖激酶2用于体液样本中稀有肿瘤细胞检测及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物与医学检测领域，具体涉及己糖激酶2用于体液样本中稀有肿瘤细胞检测及试剂盒。本发明专利技术基于肿瘤细胞能量代谢异常的原理，使用糖酵解标志物己糖激酶2(HK2)为标志物进行体外检测，通过可寻址的微孔阵列芯片或玻璃片辅助稀有肿瘤细胞定位和挑选，从而实现癌症患者体液样本中高糖酵解活性稀有肿瘤细胞的检测。采用本发明专利技术的检测方法，可以检测人体液样本中的高糖酵解活性的稀有肿瘤细胞，尤其是能够用于检测间质来源肿瘤的循环肿瘤细胞以及上皮来源肿瘤中发生上皮间质转化的循环肿瘤细胞，弥补传统基于上皮标志物检测循环肿瘤细胞的不足，为癌症液体活检更好的应用于临床提供技术基础。

【技术实现步骤摘要】
己糖激酶2用于体液样本中稀有肿瘤细胞检测及试剂盒
本专利技术涉及生物与医学检测领域。更具体地，本专利技术涉及检测人体液(如血液、脑脊液、胸腔积液、尿液等)样本中稀有肿瘤细胞的方法。
技术介绍
癌症在全球范围内发病率和致死率高，已经严重威胁人类健康。液体活检是近年来出现的肿瘤无创检测新技术。由于肿瘤细胞的高转移能力导致其从原位肿瘤病灶脱落，进而向包括血液、胸腔积液、脑脊液甚至尿液中播散并转移。从这些液体样本检测游离的稀有肿瘤细胞及其分子特征可代替对肿瘤原位病灶的活检，因此被称为液体活检。由于传统活检创伤大且经常难以进行，因此液体活检，尤其是针对血液的液体活检，由于其无创且易于获得样本，所以受到临床很大的欢迎。但其技术难点主要在于如何确定在液体样本中的某一游离细胞的确是肿瘤细胞。目前临床上鉴定恶性组织金标准是通过病理学中的形态学特征。这一方法同样可被用于鉴定液体样本(如胸腔积液、脑脊液、尿液等)中的脱落肿瘤细胞，但由于液体样本中的细胞成分复杂，存在大量与肿瘤细胞形态类似、易于混淆的细胞(如胸腔积液中的反应性间皮细胞)，同时肿瘤细胞数目可能很少，因此常常难以给出明确的结论，导致液体样本中恶性细胞检测的灵敏度较低。在血液中，由于循环肿瘤细胞数目极少，且其他细胞的数目非常大(达到109)，因此更加难以通过形态学的方法来准确检测。目前在市场上及学术界存在多种不同的检测血液中循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcell,CTC)的技术与设备，但核心的CTC鉴定标准基本都采用强生公司获得美国FDA批准的CellSearch系统中所采用的上皮标志物与白细胞标志物相结合的方式，即EpCAM+/CK+/CD45-/DAPI+且符合一定形态学标准的细胞定义为CTC，其中EpCAM与CK(细胞角蛋白)均为上皮标志物，CD45为白细胞标志物，而DAPI为细胞核标志物。因此，上述定义主要依赖上皮标志物，因为大部分肿瘤均为上皮来源，但这一标准无法检测间质来源肿瘤(如骨肉瘤、黑色素瘤等)的CTC以及上皮来源肿瘤中发生了上皮间质转化(Epithelial–MesenchymalTransition)的CTC。根据现有的癌症生物学理论，EMT是肿瘤细胞转移的重要步骤，因此从上皮型转化为间质型的肿瘤细胞与肿瘤转移密切相关，而这部分肿瘤细胞难以通过上皮标志物来检测。所以，这促使我们去研发新的CTC标志物能够更灵敏的检测CTC，尤其是间质来源肿瘤的CTC以及上皮来源肿瘤中不表达上皮标志物(如CK)的CTC。我们主要从癌症的普遍性特征入手寻找新的CTC标志物。癌症危害之大且难以攻克，源于恶性肿瘤细胞具有与正常细胞不同的若干特征，包括维持增殖信号(Self-SufficiencyinGrowthSignals)，逃避生长抑制(InsensitivitytoAntigrowthSignals)，抑制细胞死亡(ResistingCellDeath)，无限自我复制(LimitlessReplicativePotential)，诱导血管生成(SustainedAngiogenesis)，激活浸润转移(TissueInvasionandMetastasis)，避免免疫损伤(AvoidingImmuneDestruction)，促进肿瘤炎症(TumorPromotionInflammation)，能量代谢异常(DeregulatingCellularEnergetics)以及基因组不稳定(GenomeInstabilityandMutation)等(见DouglasHanahan,RobertA.Weinberg,"HallmarksofCancer:TheNextGeneration",Cell,2011,vol.144,p646-674)。其中肿瘤细胞的能量代谢异常作为癌症的主要标志之一受到越来越多的关注，它为肿瘤检测与治疗提供了新的方法与靶点。肿瘤细胞利用糖酵解作为其主要能量代谢的来源，即使在有氧的情况下也大量摄取葡萄糖，这种现象被称为Warburg效应，是肿瘤的基本特征之一。OttoWarburg也因此获得1931的诺贝尔奖。我们知道糖酵解是由一系列酶催化的级联反应过程，催化糖酵解的第一个关键限速酶就是己糖激酶(Hexokinases,HKs)。HK催化进入细胞内的葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖(G-6-P)，并消耗一分子ATP。现已发现的人类HK有4种亚型，分别由HK1、HK2、HK3和HK4基因编码生成。HK1广泛表达于几乎所有的哺乳动物组织中，HK2通常表达于胰岛素敏感组织如脂肪、骨骼和心肌中。HK3则往往低水平表达，HK4的表达则限制于胰腺和肝脏。尚未见有将HK这类激酶作为鉴定人液体样本中稀有肿瘤细胞的标志物的报道与研究。
技术实现思路
本专利技术提供了一种检测癌症患者液体样本中的稀有肿瘤细胞的方法、检测试剂盒以及HK2抗体物质的用途，以解决目前的基于上皮标志物的方法无法检测间质来源肿瘤CTC以及上皮来源肿瘤发生上皮间质转化CTC的问题，进一步提高CTC的检测灵敏度。本专利技术的第一个方面，提供一种检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法，包括：用荧光标记的己糖激酶2(HK2)抗体物质对来自人体液样本的细胞进行染色处理，对染色处理后的细胞进行荧光检测，根据荧光信号确定HK2阳性细胞，HK2高表达细胞为稀有肿瘤细胞。在上述检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法中，作为一个优选方案，将荧光检测时所有白细胞的HK2荧光值的平均值加五倍标准差作为判断HK2高表达的阈值。在上述检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法中，作为一个优选方案，还包括用荧光标记的白细胞标志物抗体对来自体液样本的细胞进行染色处理、和用细胞核染色剂对来自人体液样本的细胞进行染色处理，符合HK2高表达/白细胞标志物阴性/细胞核染色阳性的细胞为稀有肿瘤细胞。在上述检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法中，作为一个优选方案，荧光标记的HK2抗体物质是荧光标记的HK2抗体，或者是HK2抗体与荧光标记的HK2二抗的组合。在上述检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法中，作为一个优选方案，所述白细胞标志物抗体为针对细胞膜表面蛋白CD45的抗体，所述细胞核染色剂是细胞核荧光染料；将荧光检测时CD45阳性细胞的HK2荧光值的平均值加五倍标准差作为判断HK2高表达的阈值。在上述检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法中，作为一个优选方案，所述体液样本为血液、胸腔积液、脑脊液或尿液样本，所述体液样本选择性地进行富集处理后，制成细胞悬液，并以单细胞形式铺展于可寻址的微孔阵列芯片或玻璃片以进行染色处理，所述富集处理包括减少体液样本中红细胞和/或白细胞的数量。在上述检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法中，作为一个优选方案，还包括如下步骤：(a)对人体液样本进行预处理与富集；(b)将富集后的样本中的所有细胞分散于可寻址微孔阵列芯片或玻璃片上；(c)对微孔阵列芯片或玻璃片上的所有细胞进行基于标志物的荧光染色与成像；(d)根据荧光信号的阈值或采用人工智能方式识别疑似肿瘤细胞并经人工审核后计数。(e)利本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法，包括：用荧光标记的己糖激酶2(HK2)抗体物质对来自人体液样本的细胞进行染色处理，对染色处理后的细胞进行荧光检测，根据荧光信号确定HK2阳性细胞，HK2高表达细胞为稀有肿瘤细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法，包括：用荧光标记的己糖激酶2(HK2)抗体物质对来自人体液样本的细胞进行染色处理，对染色处理后的细胞进行荧光检测，根据荧光信号确定HK2阳性细胞，HK2高表达细胞为稀有肿瘤细胞。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中将荧光检测时所有白细胞的HK2荧光值的平均值加五倍标准差作为判断HK2高表达的阈值。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括用荧光标记的白细胞标志物抗体对来自体液样本的细胞进行染色处理、和用细胞核染色剂对来自人体液样本的细胞进行染色处理，符合HK2高表达/白细胞标志物阴性/细胞核染色阳性的细胞为稀有肿瘤细胞。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中荧光标记的HK2抗体物质是荧光标记的HK2抗体，或者是HK2抗体与荧光标记的HK2二抗的组合。


5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中所述白细胞标志物抗体为针对细胞膜表面蛋白CD45的抗体，所述细胞核染色剂是细胞核荧光染料；将荧光检测时CD45阳性细胞的HK2荧光值的平均值加五倍标准差作为判断HK2高表达的阈值。


6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述体液样本为血液、胸腔积液、脑脊液或尿液样本，所述体液样本选择性地进行富集处理后，制成细胞悬液，并以单细胞形式铺展于可寻址的微孔阵列芯片或玻璃片以进行染色处理，所述富集处理包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨柳，华莹奇，蔡郑东，
申请(专利权)人：苏州浚惠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32