一种消减全血环孢素测定的基质效应的分析方法技术

本发明专利技术属于分析技术领域，具体公开了一种消减全血环孢素测定的基质效应的分析方法，将待测样品和铷盐混合后电离，使样品中的环孢素形成Rb

【技术实现步骤摘要】
一种消减全血环孢素测定的基质效应的分析方法
本专利技术属于分析
，技术设计环孢素的测定方法。
技术介绍
环孢素A(cyclosporinA，CyA)是一种从丝状真菌次级代谢产物中分离出来的环状十一肽，具有高度疏水性。因其具有优秀的免疫抑制作用，1982年起应用于移植物抗宿主病的治疗，开启了器官移植的CyA时代。此外，CyA对银屑病、类风湿关节炎、干燥综合征等自身免疫性疾病也有很好的治疗价值。尽管后来不断有新的免疫抑制剂问世，但CyA目前仍然是全球器官移植和自身免疫疾病处方量最大的免疫抑制剂。不过，CyA的临床应用存在比较大的两个问题，其一是其治疗指数窄，血药浓度过低则免疫抑制不充分，容易发生移植物排斥反应或全身免疫反应，而血药浓度过高则容易继发感染、严重的肝肾毒性以及全身器官毒性反应。其二是其生物利用度和体内代谢易受多种因素的影响，血药浓度波动幅度较大，剂量与血药浓度相关性不高。为了保障疗效、降低毒副反应，常规需要监测其全血浓度来进行个体化用药调整。用于CyA治疗药物监测(TDM)的方法主要有免疫法、液相色谱-紫外法(LC-UV)和液相色谱-质谱联用法(LC-MS)。其中，LC-UV因为灵敏度低、抗干扰能力差，不适合大样本快速检测。荧光偏振免疫法、酶联免疫分析法、化学发光微粒子等免疫分析法由于简便无需专业分析人员操作，在CyA的临床测定中应用较多。免疫法的缺点是特异性不高，常常因为药物代谢物或内源性物质与抗体的交叉反应而高估CyA的浓度和产生较大的偏差，也不能像色谱法那样可同时测定两种或以上药物。另外，免疫法因为需要特定的试剂盒，其检测成本一直居高不下、至少是液质联用法的2倍或以上。液质联用法兼具液相色谱的高分离能力和质谱的高分析能力，特别是基于电喷雾电离的液质联用法具有高选择性、高灵敏度、高通量的特点，不仅适合CyA的日常TDM，也是其药代动力学和体内代谢、类似物开发等探索性研究的首选，还是免疫法等间接检测法的金标准，因此，液相色谱-电喷雾电离-串联质谱联用法(LC-ESI-MS/MS)定量分析CyA相比于其他分析手段具有更强的技术优势和成本优势，国内外的工作实践以及近年发表的大量有关环孢素的分析文献充分反映这一状况。从采用LC-ESI-MS/MS技术以来，生物样品CyA的定量检测似乎变得轻松简单，但随之而来的基质效应问题不容忽视。基质效应是指在液质联用分析中，由于色谱共洗脱物所引起的目标分析物的质谱离子化效能(质谱响应)的抑制或增强，一般以抑制多见。对于液质联用技术，分析物离子化过程的高效和稳定是其灵敏、准确分析的重要基础，基质效应的出现对定性和定量分析都有不利影响，尤其影响定量方法的重现性、线性、和准确性，因此也被称为电喷雾质谱定量分析的致命弱点。文献和我们前期工作中均发现全血等生物基质严重劣化CyA电喷雾离子化的效率和稳定，SalmP和BuchwaldA通过柱后灌注法观察到人全血基质对CyA的电喷雾质谱信号抑制达60％左右。GuadaM等分析大鼠生物样品时，发现全血和组织匀浆中CyA信号强度分别仅为纯溶液中的64％和25％。BoguszMJ等和NilsT.Vethe等报道人全血基质引起CyA信号抑制程度在20％左右。KosterRA等对干血点中CyA的测定显示约-64％的基质效应。我们最近的研究显示CyA全血基质效应在-34％～-74％之间。上述研究报道表明CyA的生物基质效应非常严重，是建立灵敏、准确和稳健的分析方法不可回避的重大障碍。除CyA以外，一些其他物质的LC-ESI-MS/MS分析也存在明显的基质效应，基质效应实际上是包括软电离为基础的液质联用分析的共同问题，但由于电喷雾质谱的广泛应用而表现最为突出。为了保障分析效度，目前普遍认为在建立电喷雾等软电离质谱分析方法时应当评估和控制基质效应，多国药政对此予以强制规定。例如2011年EMA和中国药典(2015年版)均规定采用质谱法要考察基质效应，至少要用6个不同来源，考察不高于3倍最低定量浓度(LLOQ)，以及接近最高定量浓度(ULOQ)水平的待测物和内标的基质效应。2018年美国FDA要求当使用液相色谱/质谱(LC/MS)方法时，应确定基质对离子抑制、离子增强的影响，应分析至少六个不同来源的适当生物基质(例如血浆)的空白样品，确保在整个方法应用过程中没有基质效应。用于评估基质效应的方法主要有基质提取后加入法和柱后灌注法。其中，基质提取后加入法能直观、定量反映绝对基质效应或内标校正的相对基质效应的程度和方向，在最低定量限(LLOQ)附近的浓度也可按此判断，因此运用最为广泛。绝对基质效应直接表示样品基质对分析物响应的抑制或增强程度，一般通过测定分析物在基质提取液中与纯流动相溶液中信号强度比值的升高或降低百分率，即基质因子(matrixfactor，MF)来表示。如果MF为0％，说明没有发生任何基质效应，这当然只是理想状况下的情形。考虑实际会存在误差，当MF≤±15％，可认为基质效应不明显。绝对基质效应主要影响方法的准确度，当离子抑制发生时，灵敏度和定量下限均会受损。而且绝对基质效应过大，即使有内标等校正手段，内标归一化基质因子及其变异系数也难以控制，因此在方法开发之初应尽可能采用有效措施消减绝对基质效应。相对基质效应是指分析物在不同来源或批次样品之间绝对基质效应大小的变异，可通过计算其MF的变异系数来确定。由于液质联用法普遍采用内标法定量，待测物与内标MF的比值称为内标归一化基质因子，因此相对基质效应可以用各来源样品内标归一化基质因子的变异系数来判断，其值应小于15％。相对基质效应影响方法的精密度，与定量方法能否通过验证关系很大。控制相对基质效应一方面依赖于对绝对基质效应的消减程度，另一方面需要选择合适内标。为了消减基质效应对于CyA生物样品分析的不利影响，分析工作者一直在探索其发生原因和可能的消减办法。尽管采用LC-ESI-MS/MS分析CyA为时不短，但分析界对其生物基质效应的确切原因和和发生机制并不完全明了。因此，迄今在文献或分析实践中缺乏针对CyA生物基质效应产生机理的特异性对抗或消减办法，而只能选用一些非选择性的手段，主要包括：⑴样品深度纯化：采用液液萃取、固相萃取或在线柱萃取(二维液相色谱)来深度纯化样品，尽可能减少样品中的杂质，从而减轻色谱共流出物对CyA电喷雾电离的影响；⑵改善色谱分离能力：色谱分离采用梯度洗脱方式，让CyA的保留时间尽可能避开样品中可能导致基质效应的杂质的流出时间，减少干扰CyA分析的共洗脱组分，从而改善基质效应；⑶调整流动相化学：LC-ESI-MS/MS法常常利用液相色谱电解质效应，通过在流动相中添加适当的电解质，以促进分析物的电喷雾电离效能和增强其抵抗基质影响的能力。分析CyA的流动相一般添加含H+、NH4+、Na+的有机弱酸或电解质，但文献数据证明单独采用该技术不能有效消减CyA的基质效应。⑷同位素内标：选用CyA的稳定同位素作为内标使用，以校正绝对基质效应所导致的CyA质谱响应的变化，从而保持定量的相对准确和精确。上述这些技术手段涉及到CyA生物样品分析过程的方方面面，也非常耗时费力，虽然或多或少能解本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种消减全血环孢素测定的基质效应的分析方法，其特征在于，将待测样品和铷盐混合后电离，使样品中的环孢素形成Rb

【技术特征摘要】
1.一种消减全血环孢素测定的基质效应的分析方法，其特征在于，将待测样品和铷盐混合后电离，使样品中的环孢素形成Rb+-Cy加合物，随后再进行质谱分析；
所述的铷盐为铷离子的单羧酸根盐。


2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的环孢素为CyA、CyB、CyC、CyD中的至少一种。


3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的待测样品由待测全血样品纯化得到；
优选地，所述的纯化手段为蛋白沉淀法：
进一步优选，所述的待测样品的获取步骤为：获取全血样品、裂解红细胞，再加入蛋白沉淀剂沉淀全血蛋白，随后经离心处理，获得上清液，即为待测样品；
优选地，所述的蛋白沉淀剂为乙腈、甲醇、丙酮中的至少一种。


4.如权利要求1～3任一项所述的分析方法，其特征在于，将所述的铷盐添加在待测样品中，混合后进行电离、质谱分析。


5.如权利要求1～4任一项所述的分析方法，其特征在于，对待测样品进行色谱-电离-质谱联用分析；其中，在进入电离阶段前的样品溶液中添加所述的铷盐；
优选地，在色谱阶段的流动相中添加铷盐，或者，在进入电离阶段前的色谱洗脱液中添加铷盐。


6.如权利要求5所述的分析方法，其特征在于，色谱-电离-质谱联用分析过程中：
所述的色谱阶段的色谱柱为C18色谱柱、C8色谱柱、C4色谱柱、苯基色谱柱或氰基色谱柱；
优选地，色谱阶段的洗脱条件为：色谱柱柱温：35～45℃；流速：0.3～0.5ml·min-1，等度洗脱；色谱进样体积：4.0～5.0μl。


7.如权利要求1～6...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱荣华，李焕德，方平飞，张毕奎，滕婧，颜苗，蔡骅琳，彭文兴，方春华，
申请(专利权)人：中南大学湘雅二医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43