一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术制造技术

本发明专利技术提供一种新型循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)的鉴定技术，其特征在于：肿瘤患者体液(如外周血)经标准取样、运输存放、样本前处理、CTC富集分离于微孔滤膜上、固定细胞、细胞银染和免疫荧光原位检测步骤，从核质比例、不规则核仁特征及数量来确定是否是肿瘤细胞，最后通过组织器官特异性蛋白标志物的荧光免疫检测，确定血液中CTC的器官组织来源。本发明专利技术在原位镜检CTC，既检测肿瘤细胞,又确定循环肿瘤细胞的器官组织来源,解决长期以来CTC形态学鉴定缺乏令人信服的方法，有助于为CTC的检测建立统一的标准。本发明专利技术具有易于操作、重复性好、稳定性强等优点,可用于肿瘤高危人群的早期筛查、癌症患者的疗效评估及复发监控。

【技术实现步骤摘要】
一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术
本专利技术属于医学诊断
，具体涉及一种新型循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell,CTC)的鉴定技术。
技术介绍
肿瘤可分实体瘤及非实体瘤二大类，前者由上皮或内皮组织细胞分化而形成的肿块，而后者是造血系统细胞形成的，如淋巴细胞癌，不形成肿块。肿瘤细胞从实体肿瘤原发灶或转移灶脱落，进入人体循环系统而形成循环肿瘤细胞(CTC)，存在于外周血中。CTC以游离的单个细胞形式存在，或呈细胞团(CirculatingTumorMicroemboli,CTM)形态。这些细胞是肿瘤转移的基础，研究CTC有助于揭示恶性肿瘤发生及转移的机制，CTC也用于临床疗效评估及复发监控。CTC在肿瘤患者外周血中十分稀少,每5毫升外周血仅含数个至数百个CTC，而每毫升成人外周血存在数百万白细胞及数亿红细胞，为此对CTC检测技术的灵敏度和特异性提出了极高的要求。CTC鉴定是肿瘤液体活检(LiquidBiopsis)的重要组成部分,其无创或微创及实时动态检测的优点,是当今肿瘤诊疗的重要方向,有广阔的应用前景。目前针对CTC，有许多的检测方法，尤其CTC的检测主要包括CTC分离和富集系统以及鉴定系统，合适的分离和富集系统是能否有效检测外周血CTC的前提。用于临床实验研究的CTC分离和富集技术，主要根据CTC物理性质(如大小、密度等性质)和CTC表面与捕获基质的亲和性(如CTC表面的特异性抗原与带有相应抗体的相互作用)。由于CTC的高度异质性,基于某一CTC类型的特性去富集,有可能造成其它CTC类型的缺失而造成漏检。一些血细胞具有CTC相近的物理性质,以此性质来分离CTC,会同时富集这些血细胞。此外不少肿瘤细胞特异性抗原尚未知,理想的抗体常常缺乏。常用的CTC分离富集技术有以下几类:(1)密度梯度离心法(DensityGradientCentrifugation，DGC):基于血液中各种细胞与CTC密度的差别，在密度梯度介质中的沉降系数不同，将细胞悬液置于分离液介质的顶部，通过重力或离心力的作用，将CTC与其它细胞层分离。该法操作简便、成本低，但要求血量较大，且灵敏度和特异性均较低，CTC与白细胞等单核细胞在同一密度梯度,且操作过程中会损失CTC。(2)上皮性肿瘤细胞过滤技术(IsolationbySizeofEpithelialTumorCells，ISET):ISET方法是基于细胞大小不同用具有一定孔径的微孔滤膜来筛选。肿瘤细胞的直径一般为15～30μm，大于大多数血细胞的直径(如红细胞5～9μm)，所设计的微孔滤膜(直径8或10μm)过血液样本后将直径大的肿瘤细胞分离出来。该方法对技术、设备要求不高，但不适合直径小于滤膜孔径的肿瘤CTC的分离富集。(3)免疫磁珠分离技术(Immunomagneticseparation，IMS)：CTC具有某些特殊的生物标志物，如CTC表面的上皮细胞粘附分子(EpithelialCellAdhesionMolecule，EpCAM)、细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)，而带有EpCAM抗体磁珠在外加磁场中捕获EpCAM阳性的CTC。该方法的敏感性受到CTC表面抗原表达的制约，对EpCAM阴性CTC会造成漏检。肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中会发生上皮-间质转变(EpithelialMesenchymalTransition,EMT),一些CTC会减少甚至不表达EpCAM蛋白。(4)细胞粘附技术(CellAdhesionTechniques，CAT):利用生物化学或物理学原理修饰捕获CTC的基质表面,增强CTC与基质的亲和粘附性，当含有CTC的样本经过捕获表面时，CTC则被吸附在捕获表面，然后冲洗掉未被粘附的其它细胞。比如纳米基质分离技术(Nanoimprintmatrixisolationtechnology)是在纳米尺度对基底表面制备纳米结构设计细胞界面，并修饰相应的特异性识别分子，将血液中的CTC捕获并分离出来。又如微流控技术(Microfluidics)在微流控器件中,从血液样品流入到CTC分选,可以实现连续的过程，极大地简化了操作程序，并可减少目标细胞的损失,且所用血液样本微量,但要克服样本中细胞凝集成团造成阻塞的问题。(5)微流控芯片技术(Microfluidicchiptechnology)是将生物医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程，称之谓芯片实验室(labonachip)。微流控技术可在微米结构中操控极微量体积液流，基于微流控芯片的CTC分离技术通过在芯片通道内部修饰可识别的细胞表面抗原的抗体或适合配体，当通入含CTC的样本时，CTC与通道表面捕获试剂结合，实现特异性分离。该方法所需样品量小，无需对血液样品进行前处理，且流动的流体环境有利于去除非特异性吸附的其它细胞，从而提高分离纯度。经过上述方法分选富集的CTC需要进一步分析鉴定，选用特异性的检测技术或方法对CTC及其分子进行确认是循环肿瘤细胞检测的重要步骤。常用的鉴定检测技术包括免疫细胞化学技术(Immunocytochemistry，ICC)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光原位杂交技术(FluorescenceInSituHybridization，FISH)和流式细胞术(FlowCytometry，FCM)等。其中ICC及常规细胞染色技术是最基本的鉴定方法，但目前选择的循环肿瘤细胞的相关抗原包括EpCAM、上皮角质蛋白(CKs)、肿瘤相关蛋白或特异性标志物，该方法人工操作步骤复杂,需人工检测,误差大。近年来研发出的光纤阵列扫描仪(Fiberscanningtechnology，FAST)、激光扫描细胞计量仪(Laserscanningcytometry，LSC)、自动细胞显像系统(Automatedcellularimagingsystem，ACIS)等，使检测系统有了很好的协同性，能完成高速扫描、准确定位免疫荧光标记的肿瘤细胞，提高了扫描荧光染色细胞的有效率和灵敏度。由于肿瘤细胞表面抗原表达的不均一性，在一定程度上降低了检测的灵敏度。随着人工智能技术的快速发展,检测的人为差异性将进一步减少。对于CTC的细胞形态鉴定，仍缺乏共识和公认的标准。流行的方法(CD45-，表明非白细胞；Dapi核染色，表明非红细胞；细胞角蛋白(Cytokeratin18or19,CK18orCK19或波形蛋白,不少肿瘤细这些蛋白标志物常有过表达的趋势)，但不少正常上皮细胞也具这些蛋白标志物,用这些蛋白标志物，荧光显微检测难以区分肿瘤细胞与正常上皮细胞，由于不能有效快速并且精准地鉴定CTC，是当今该技术在临床应用中面临的主要瓶颈。银染法是经典的细胞染色技术(HowellW.M.andBlackD.A.1980,Experimentia,336,1014-1015)。细胞银染法常用于恶性细胞的核仁嗜银形成区及核型分析，染色原理是基于银离子在甲酸作用下还原成金属银，染色结果是细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：患者体液依次经取样、样本前处理、CTC富集分离于微孔滤膜上、固定细胞、细胞银染和免疫荧光原位检测步骤，从核质比例、不规则核仁特征及数量来确定是否是肿瘤细胞，最后通过组织器官特异性蛋白标志物的荧光免疫检测，确定血液中CTC的器官组织来源。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：患者体液依次经取样、样本前处理、CTC富集分离于微孔滤膜上、固定细胞、细胞银染和免疫荧光原位检测步骤，从核质比例、不规则核仁特征及数量来确定是否是肿瘤细胞，最后通过组织器官特异性蛋白标志物的荧光免疫检测，确定血液中CTC的器官组织来源。


2.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述固定细胞步骤和细胞银染步骤之间还有微孔膜的前处理步骤。


3.根据权利要求2所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述微孔膜的前处理为：用0.01NHCl处理3-5min，水洗后用0.05％TritonX-100/PBS处理3-5min，再水洗。


4.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述细胞银染步骤与免疫荧光原位检测步骤之间还设有银染后的再固定步骤及Triton处理步骤，银染后的再固定步骤为用醋酸溶液固定处理。


5.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述微孔膜为圆形或锥形微孔膜，直径0.5-1cm，微孔直径8或10微米。


6.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述细胞固定步骤为：用1ml固定液加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴少波，陈利民，
申请(专利权)人：中国医学科学院输血研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51