一种石蜡包埋食管癌组织中制备肽段的方法技术

一种石蜡包埋食管癌组织中制备肽段的方法，包括以下步骤：S1：脱蜡；S2：水化；S3：依次加入1ml的70％酒精，并在室温下孵育10分钟；S4：溶解样本；S5：将S4得到蛋白质溶液转移至Barocycler匹配试管内，放置于Barocycler固定位上，程序设置为95℃下，共60个循环，其中每个循环内40000psi，时间50秒，紧接着5000psi，时间10秒；S6：将沉淀保存至‑80℃冰箱；S7：冷冻丙酮溶液沉淀蛋白质；S8：4℃下16000g离心10分钟去除丙酮；S9：定量蛋白质；S10：肽段消化；S11：磷酸化肽段的富集。本发明专利技术提高了工作效率，降低了堵塞导致的样本丢失。

【技术实现步骤摘要】
一种石蜡包埋食管癌组织中制备肽段的方法
本专利技术涉及蛋白质研究中的肽段的制备，特别涉及石蜡包埋食管癌组织中制备肽段的方法，属于生物

技术介绍
临床蛋白质组学研究是通过发现不同病患和健康人之间的蛋白质及其修饰水平的表达丰度差异,以实现疾病人群的分子分型，发现潜在的药物干预靶标和诊断标志物。活检或手术切除组织是临床治疗过程中可获取的基本样本，包括新鲜/冻存和福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-fixedandparaffin-embedding,FFPE)的组织样本。其中FFPE组织在常温下可稳定储存数十年,是组织病理学分析的金标准。自该技术诞生的一个世纪发展,在全世界临床上已经累积了大量的FFPE组织样本。FFPE组织样本的一个重要优势是具备长期的临床随访信息,包括个体生活史、疾病分期、无病生存期和死亡时间等信息。这些信息对于多组学分析和目标导向的精准医学实践异常重要,而这往往是新鲜冻存组织难以达到的。基于患者人群的FFPE组织开展差异蛋白质组学研究，可以充分利用罕见疾病或肿瘤等样本,发现与疾病诊断、分型、预后及治疗密切相关的靶蛋白。从技术角度,FFPE组织由于经过甲醛固定、脱水和封蜡等处理，且通常只能获得几个微米厚度的切片，因此针对微量切片的FFPE组织蛋白质提取和消化、质谱分析等过程,本身又构成了极大的挑战。如何保证在提取包埋样本内蛋白质的过程中，保证不丢失蛋白质，保护原有蛋白质上的修饰重要信息，且该操作简便，能够在大部分临床机构内开展，蛋白质组研究者面对的现实问题。对FFPE样本内蛋白质提取中肽段制备的主要报道如下，主要集中表现在不同提取裂解液的选取和总蛋白质充分酶解的质谱检测：1.Broeckx等对比了8种不同蛋白裂解液的提取效率，阐明了在提取液中加入2%十二烷基硫酸钠后，蛋白的回收率提高了15倍。MolecularBiosystems,2016,12(2):553-5652.Gawin等在2018年将人甲状腺癌的石蜡包埋组织样本用单独胰蛋白酶酶切和Lyc-C与胰蛋白酶联用进行了比较，多酶联用中鉴定到了4800基因(单独胰蛋白酶酶切鉴定到3700多种基因)。J.ProteomeRes，2018,18（1）：426-435。基于目前的蛋白质组学研究中的肽段制备方法，研究更为全面的高效肽段制备方法是有助于提高其研究水平。
技术实现思路
本专利技术的目的在于进一步优选蛋白质组学研究中肽段制备方法。为实现本专利技术的目的，采用了下述的技术方案：一种石蜡包埋食管癌组织中制备肽段的方法，包括以下步骤：S1：脱蜡：将连续的5~10张每张厚度5μm石蜡包埋切片置于1个2ml离心管内，加入1ml的100％二甲苯并孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500g下离心10分钟，然后除去二甲苯溶液；再次添加1ml的100％二甲苯并重复上述步骤1次；S2：水化：步骤S1脱腊后加入1ml的100％酒精，并在室温下孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500g离心10分钟去除酒精；S3：依次加入1ml的70％酒精，并在室温下孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500g离心10分钟除去酒精，再加入1ml去离子水，进行同样的上述步骤1次，离心后，将材料在室温下干燥5分钟；S4：溶解样本：在S3得到的材料中加入0.5-0.7ml裂解缓冲液，裂解缓冲液组成为0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.1M二硫苏糖醇、质量浓度0.5%聚乙二醇20000、质量浓度1%十二烷基硫酸钠，并在加热震荡仪上以1200rpm和99℃下孵育30分钟；S5：将S4得到蛋白质溶液转移至Barocycler匹配试管内，放置于Barocycler固定位上，程序设置为95℃下，共60个循环，其中每个循环内40000psi，时间50秒，紧接着5000psi，时间10秒；S6：程序结束，取出蛋白质溶液，转至2ml离心管内，4℃下16000g离心20分钟，吸取上清，将沉淀保存至-80℃冰箱；S7：冷冻丙酮溶液沉淀蛋白质去除十二烷基硫酸钠等分子对后续消化步骤的影响：按照冷冻丙酮和蛋白质溶液体积比3:1，冷冻在-20℃过夜沉淀蛋白质；S8：4℃下16000g离心10分钟去除丙酮，再次按照4倍体积加入冷冻丙酮洗涤沉淀，4℃下16000g离心10分钟后去除丙酮，置于通风橱内完全干燥蛋白质沉淀；S9：定量蛋白质：加入100μl~200μl的蛋白质溶解缓冲液，缓冲溶液为50mM三乙基碳酸氢铵、8M尿素缓冲液，经过超声溶解后，4℃下16000g离心10分钟后保留上清，经过蛋白质定量后备用；S10：肽段消化：根据步骤S9对蛋白质定量的结果，每含1mg蛋白质裂解溶液中，加入终浓度为5mM二硫苏糖醇，室温孵育10分钟后，加入终浓度为10mM碘乙酰胺，室温下避光孵育20分钟，加入4倍上述总体积的50mM三乙基碳酸氢铵以及1%蛋白质总质量的胰蛋白酶，在加热震荡器上震荡至少12小时；充分消化的肽段经C18除盐后，-80℃冻干备用；S11：磷酸化肽段的富集：本步骤中富集总蛋白初始量1mg，对应使用10μl琼脂糖珠，琼脂糖珠采用50μl-100μl/每1.5mlEP管；包括以下S11的子步骤S11A、S11B、S11C、S11D、S11E、S11F、S11G；S11A：活化的琼脂糖珠制备：包括以下S11A子步骤：S11A1：500μl的100mM乙二胺四乙酸孵育洗脱含镍的琼脂糖珠，室温下，旋转孵育盘上500转/分钟，2次，每次5分钟；S11A2：500μl10mM三氯化铁水溶液中孵育S11A1得到的琼脂糖珠，室温下，旋转孵育盘上500转/分钟，2次，每次5分钟；S11A3：500μl80%乙腈/0.1%三氟乙酸孵育S11A2得到的琼脂糖珠，室温下，旋转孵育盘上500转/分钟，2次，每次5分钟；得到活化的琼脂糖珠；S11B.：溶液重悬肽段：步骤S10中得到的已干燥的磷酸化肽段溶解在80%乙腈/0.1%三氟乙酸溶液中，终浓度为0.5μg/μl；S11C：每1mg肽段混合物中移入活化的10μl琼脂糖珠，在室温下，于孵育旋转器上结合30分钟以上；S11D：从琼脂糖珠上洗脱磷酸化肽段，包括以下S11D子步骤S11D1：用50μl80%乙腈/0.1%三氟乙酸和100μl1%甲酸各洗涤琼脂糖珠2次；S11D2：pH7.0，500mM磷酸氢二钠洗脱液70μl从琼脂糖珠上洗脱磷酸化肽段，重复3次，收集全部洗脱液；S11E：C18小柱的预先制备：100μl甲醇洗涤2次，50μl50%乙腈/0.1%甲酸洗涤2次，100μl1%甲酸洗涤平衡C18小柱2次；S11F：从C18小柱洗脱磷酸化肽段：将S11D2中全部洗脱液上样C18小柱后，100μl1%甲酸洗涤2次，然后用60μl50%乙腈/0.1%甲酸从C18小柱洗脱磷酸化肽段3次；S11G：所有洗脱液合并一管，得到肽段，干燥供高分辨质谱检测用。本专利技术的积本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种石蜡包埋食管癌组织中制备肽段的方法，其特征在于包括以下步骤：/nS1：脱蜡：将连续的5~10张每张厚度5μm石蜡包埋切片置于1个2ml离心管内，加入1ml的100％二甲苯并孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500 g下离心10分钟，然后除去二甲苯溶液；再次添加1ml的100％二甲苯并重复上述步骤1次；/nS2：水化：步骤S1脱腊后加入1ml的100％酒精，并在室温下孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500 g离心10分钟去除酒精；/nS3：依次加入1ml的70％酒精，并在室温下孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500 g离心10分钟除去酒精，再加入1ml去离子水，进行同样的上述步骤1次，离心后，将材料在室温下干燥5分钟；/nS4：溶解样本：在S3得到的材料中加入0.5-0.7ml裂解缓冲液，裂解缓冲液组成为0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.1M二硫苏糖醇、质量浓度0.5%聚乙二醇20000、质量浓度1%十二烷基硫酸钠，并在加热震荡仪上以1200 rpm和99℃下孵育30分钟；/nS5：将S4得到蛋白质溶液转移至Barocycler匹配试管内，放置于Barocycler固定位上，程序设置为95℃下，共60个循环，其中每个循环内40000psi，时间50秒，紧接着5000psi，时间10秒；/nS6： 程序结束，取出蛋白质溶液，转至2ml离心管内，4℃下16000g离心20分钟，吸取上清，将沉淀保存至-80℃冰箱；/nS7： 冷冻丙酮溶液沉淀蛋白质去除十二烷基硫酸钠分子对后续消化步骤的影响：按照冷冻丙酮和蛋白质溶液体积比3:1，冷冻在-20℃过夜沉淀蛋白质；/nS8： 4℃下16000g离心10分钟去除丙酮，再次按照4倍体积加入冷冻丙酮洗涤沉淀，4℃下16000g离心10分钟后去除丙酮，置于通风橱内完全干燥蛋白质沉淀；/nS9： 定量蛋白质：加入100μl~200μl的蛋白质溶解缓冲液，缓冲溶液为50mM 三乙基碳酸氢铵、8M尿素缓冲液，经过超声溶解后，4℃下16000g离心10分钟后保留上清，经过蛋白质定量后备用；/nS10： 肽段消化：根据步骤S9对蛋白质定量的结果，每含1 mg蛋白质裂解溶液中，加入终浓度为5 mM二硫苏糖醇，室温孵育10分钟后，加入终浓度为10 mM碘乙酰胺，室温下避光孵育20分钟，加入4倍上述总体积的50 mM 三乙基碳酸氢铵以及1%蛋白质总质量的胰蛋白酶，在加热震荡器上震荡至少12小时；充分消化的肽段经C18除盐后，-80℃冻干备用；/nS11：磷酸化肽段的富集： 本步骤中富集总蛋白初始量1mg，对应使用10 μl琼脂糖珠，琼脂糖珠采用50 μl-100 μl/每1.5 ml EP 管；包括以下S11的子步骤S11A、S11B、S11C、S11D、S11E、S11F、 S11G；/nS11A：活化的琼脂糖珠制备：包括以下S11A子步骤：/nS11A1：500 μl的100 mM 乙二胺四乙酸孵育洗脱含镍的琼脂糖珠，室温下，旋转孵育盘上500转/分钟，2次，每次5分钟；/nS11A2：500 μl 10 mM三氯化铁水溶液中孵育S11A1得到的琼脂糖珠，室温下，旋转孵育盘上500转/分钟，2次，每次5分钟；/nS11A3：500 μl 80%乙腈 / 0.1%三氟乙酸孵育S11A2得到的琼脂糖珠，室温下，旋转孵育盘上500转/分钟，2次，每次5分钟；得到活化的琼脂糖珠；/nS11B.：溶液重悬肽段：步骤S10中得到的已干燥的磷酸化肽段溶解在80%乙腈 / 0.1%三氟乙酸溶液中，终浓度为0.5 μg/μl；/nS11C：每1 mg肽段混合物中移入活化的10 μl琼脂糖珠，在室温下，于孵育旋转器上结合30分钟以上；/nS11 D：从琼脂糖珠上洗脱磷酸化肽段，包括以下S11D子步骤/nS11 D1：用50 μl 80 %乙腈 / 0.1%三氟乙酸和100 μl 1% 甲酸各洗涤琼脂糖珠2次；/nS11 D2：pH7.0，500 mM磷酸氢二钠洗脱液70 μl从琼脂糖珠上洗脱磷酸化肽段，重复3次，收集全部洗脱液；/nS11E： C18 小柱的预先制备：/n100 μl甲醇洗涤2次，50 μl 50%乙腈 / 0.1%甲酸洗涤2次，100 μl 1%甲酸洗涤平衡C18 小柱2次；/nS11 F：从C18 小柱洗脱磷酸化肽段：/n将S11D2中全部洗脱液上样C18小柱后，100 μl 1%甲酸洗涤2次，然后用60 μl 50%乙腈/ 0.1%甲酸 从C18 小柱洗脱磷酸化肽段3次；/nS11G：所有洗脱液合并一管，得到肽段，干燥供高分辨质谱检测用。/n...

【技术特征摘要】
1.一种石蜡包埋食管癌组织中制备肽段的方法，其特征在于包括以下步骤：
S1：脱蜡：将连续的5~10张每张厚度5μm石蜡包埋切片置于1个2ml离心管内，加入1ml的100％二甲苯并孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500g下离心10分钟，然后除去二甲苯溶液；再次添加1ml的100％二甲苯并重复上述步骤1次；
S2：水化：步骤S1脱腊后加入1ml的100％酒精，并在室温下孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500g离心10分钟去除酒精；
S3：依次加入1ml的70％酒精，并在室温下孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500g离心10分钟除去酒精，再加入1ml去离子水，进行同样的上述步骤1次，离心后，将材料在室温下干燥5分钟；
S4：溶解样本：在S3得到的材料中加入0.5-0.7ml裂解缓冲液，裂解缓冲液组成为0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.1M二硫苏糖醇、质量浓度0.5%聚乙二醇20000、质量浓度1%十二烷基硫酸钠，并在加热震荡仪上以1200rpm和99℃下孵育30分钟；
S5：将S4得到蛋白质溶液转移至Barocycler匹配试管内，放置于Barocycler固定位上，程序设置为95℃下，共60个循环，其中每个循环内40000psi，时间50秒，紧接着5000psi，时间10秒；
S6：程序结束，取出蛋白质溶液，转至2ml离心管内，4℃下16000g离心20分钟，吸取上清，将沉淀保存至-80℃冰箱；
S7：冷冻丙酮溶液沉淀蛋白质去除十二烷基硫酸钠分子对后续消化步骤的影响：按照冷冻丙酮和蛋白质溶液体积比3:1，冷冻在-20℃过夜沉淀蛋白质；
S8：4℃下16000g离心10分钟去除丙酮，再次按照4倍体积加入冷冻丙酮洗涤沉淀，4℃下16000g离心10分钟后去除丙酮，置于通风橱内完全干燥蛋白质沉淀；
S9：定量蛋白质：加入100μl~200μl的蛋白质溶解缓冲液，缓冲溶液为50mM三乙基碳酸氢铵、8M尿素缓冲液，经过超声溶解后，4℃下16000g离心10分钟后保留上清，经过蛋白质定量后备用；
S10：肽段消化：根据步骤S9对蛋白质定量的结果，每含1mg蛋白质裂解溶液中，加入终浓度为5mM二硫苏糖醇，室温孵育...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪媛媛，李军扩，申敬伟，王能超，王巍云，侯建彬，
申请(专利权)人：安阳市肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：河南;41