用受体复合物三维模型筛选人白细胞介素-6的超激动剂、拮抗剂和超拮抗剂的方法技术

已知类似白细胞介素６（ＩＬ－６）的细胞因子组的配体（即制癌蛋白Ｍ（ＯＳＭ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、睫状神经营养因子（ＣＮＴＦ）和白细胞介素１１（ＩＬ １１）可诱导含膜分子ｇｐ１３０的受体复合物的形成。本发明专利技术涉及筛选ＩＬ－６的超激动剂、拮抗剂和超拮抗剂的方法。该方法包括以下步骤：－－比较牛粒细胞集落刺激因子（ｂＧ－ＣＳＦ）和所述激素的氨基酸序列：－－在上述比较的基础上，构建ＩＬ－６三维模型，可通过该模型鉴别分别构成与特异受体相互作用的位点（位点１）和与ｇｐ１３０相互作用的位点（位点２）的残基。本发明专利技术可用于鉴别人ＩＬ－６中这些位点并分离对受体有更大亲和力（超激动剂或超拮抗剂）或与ｇｐ１３０亲和力减少或丧失（拮抗剂或超拮抗剂）的所述野生型激素的变体。附图表示了用于鉴别人ＩＬ－６位点１和位点２的方案。本发明专利技术也描述了白细胞介素－６的具体超激动剂或超拮抗剂的获得方法和超拮抗剂作为野生型白细胞介素依赖性人骨髓瘤细胞生长的低剂量抑制剂的用途。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用三维模型筛选人白细胞介素-6(以下简称为hIL-6或IL-6)的超激动剂、拮抗剂和超拮抗剂的方法。已知Genetec公司的WO92/21029教导了确定同生长激素和配体有相似结构构象的激动剂或拮抗剂的方法。这些潜在的激动剂和拮抗剂与激素受体相接触会形成一个三元复合物，该复合物包含一分子潜在的激动剂或拮抗剂和两分子被激动或拮抗的这样的激素受体。配体分子诱导受体二聚化是由于配体有两个不同的作用位点(位点1和位点2)，通过这两个位点的诱变而产生激动剂或拮抗剂是可能的。已知类似白细胞介素-6的细胞因子组中的配体，如制癌蛋白M(OSM)，白血病抑制因子(LIF)，睫状神经营养因子(CNTF)和白细胞介素11(IL-11)诱导含膜分子gp130的受体复合物的形成。在此受体复合物中，这些细胞因子各自的特异受体和膜分子gp130总是共同元件。因此可以推断位点1和位点2结合此类激素的两种不同分子位点1结合特异受体，位点2结合gp130。鉴别所述两个位点是可能的，从以下可以更清楚地看到这一点，即构建基于人生长激素(hGH)受体序列和所研究的激素受体序列之间的功能相似性的三维模型。通过构建携带野生型和突变型激素的丝状噬菌体文库(如M13)可分离到就野生型而论对特异受体(超激动剂或超拮抗剂)有更大亲和力的突变体。按照本专利技术，本专利技术所采用的与WO92/21029所采用的三维模型(如IL-6的)之间的差异导致鉴别出螺旋A和C的不同残基作为位点2成员。实际上，按照本专利技术，就构建IL-6模型而言，用不同细胞因子的结构而不是生长激素结构为模板。人白细胞介素-6分子模型构建如下，从文献数据可知，人IL-6表现出与粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的氨基酸序列的相似性。以用X-射线晶体学测定的牛粒细胞集落刺激因子(bG-CSF)三维结构为模板研究人IL-6残基16到184的三维模型。首先，对比人IL-6与bG-CSF的氨基酸序列。基于衍化的线性排列，利用电脑化的相互作用图表仪(Unit)中的分子模型构建程序，将bG-CSF三维结构中的氨基酸残基用人IL-6对应的残基取代。排列对比过程中的缺失或插入(表明IL-6分子中不同的局部结构)的调整由分子模型构建程序提供的选择完成。建立于bG-CSF结构之上的这种IL-6三维模型使得能够确定人IL-6及其两个受体间相互作用的两上位点低亲和力受体gp80(位点1)和高亲和力信号传导受体gp130(位点2)。下述步骤用以确定这两个位点。从序列对比可知，造血受体家族所有成员相互联系，因为它们都有一个结构域，即细胞因子结合域。序列的这种相似性也表明包括gp80和gp130这两个IL-6受体在内的众多受体相应部位很可能有结构相似性。结合这些受体的细胞因子都有(或预计有)四螺旋束的相似结构的观察结果，有力支持了生物活性复合物中细胞因子及其受体通过细胞因子结合域相互作用必定是非常类似的(尽管不完全相同)这一观点。鉴于用X-射线晶体学确定了这些受体复合物(生长激素和生长激素二聚化受体的胞外域的复合物，即GHbp)之一的三维结构，我们的bG-CSF基础上建成的人IL-6的模型允许我们鉴别IL-6与其两个受体gp80(位点1)和gp130(位点2)间相互作用的潜在位点。按照本专利技术，此任务已经通过构建gp80和gp130的结构模型完成，模型构建是基于用生长激素受体X-射线晶体学结构和用我们的G-CSF基础上建立的人IL-6模型代替这种复合物中生长激素所达成的一致性(见附图说明图1)。如上所述，已知IL-6是一个184个氨基酸的多肽，属于螺旋细胞因子类。它是多种细胞产生的多功能细胞因子。它作为诸如免疫系统细胞、肝细胞、肾细胞、造血干细胞、角质形成细胞和神经元等多种细胞系的分化和生长因子。IL-6超激动剂的产生允许使用比许多严重疾病治疗中所需的野生型IL-6剂量低的治疗剂量。实际上，在治疗乳腺癌、白血病、传染病或与骨髓祖细胞失常有关的疾病中，IL-6有重要作用，并且应用前景可观。另外，IL-6超激动剂可用于骨髓移植和基因治疗中造血祖细胞离体扩增方案中。另一方面，人IL-6拮抗剂和超拮抗剂可抑制众多以IL-6过量为特征的疾病中IL-6的作用。这些疾病有慢性自体免疫疾病、骨髓瘤/浆细胞瘤、绝经后的骨质疏松症和癌性恶骨质。按照本专利技术，筛选IL-6的超激动剂、拮抗剂和超拮抗剂包括以下步骤——比较中粒细胞集落刺激因子(bG-CSF)和所说激素的氨基酸序列。——在上述比较基础上，构建IL-6三维模型，可通过该模型鉴别分别构成与特异受体相互作用的位点(位点1)和与gp130相互作用的位点(位点2)的残基。为筛选IL-6超激动剂，按照本专利技术的方法还包括下述其它的操作步骤——建立一系列包含下述IL-6野生型残基突变的噬菌体文库(以与丝状噬菌体蛋白融合产物的形式存在)螺旋ASer22，Glu23，Asp26，Arg30，Leu33，Ser37，Arg40，Glu42；环ABSer52，Ser53，Ala56，Leu57，Glu59.Asn60，Leu62，Leu64，Pro65，Lys66，Met67，Ala68，Glu69，Lys70，Asp71，Phe74，Gln75，Ser76；螺旋DHis164，Leu165，Arg168，Ser169，Lys171，Glu172，Phe173，Gln175，Ser176，Ser177，Leu178，Arg179，Ala180，Leu181，Arg182，Gln183，Met184；——从属于各个噬菌体文库并表达IL-6变体的噬菌体混合群中筛选出比野生型白细胞介素与特异受体有更大亲和力的噬菌体；和——通过测序从所选噬菌体粒子抽提的DNA来鉴别最佳受体结合氨基酸序列。在这种情况下，可产生一系列以与M13pIII蛋白的融合产物存在的含IL-6的所说野生型残基的变体的噬菌体文库。筛选本专利技术的IL-6拮抗剂的方法除上述建立人IL-6蛋白及其受体链的分子模型构建操作外还包括下述操作步骤——用常规分子生物学技术诱变鉴别为形成与gp130作用的位点的残基(Arg30，Tyr31，Gly35，Ser37，Ala38，Ser118，Lys120，Val121，Gln124，Phe125，Gln127，Lys128和Lys129)；——评价以上产生的变体的生物学活性和与特异IL-6受体的亲和力，用以鉴别与特异受体有正常亲和力而生物学活性降低或丧失的白细胞介素6变体；和——评价上述作为拮抗剂的野生型IL-6变体在人细胞系上的生物学活性。通过将决定拮抗活性的氨基酸序列的突变(以上鉴别的)和决定与IL-6特异受体增加的亲和力的氨基酸突变相结合，可能获得IL-6超拮抗剂。在获得白细胞介素6的拮抗剂或超拮抗剂的方法中，可以用选自聚合酶链反应、引物延伸、寡核苷酸定向诱变和这些方法的组合的分子生物学技术完成以上鉴别的残基的突变。本专利技术不限于筛选IL-6的超激动剂、拮抗剂或超拮抗剂的方法。相反，它涉及可由所述筛选方法获得的分子，即涉及除了具有下列三种取代Gln175Ile/Ser176 Arg/Gln183Ala的称作IL-6IRA的分子外的hIL-6超激动剂；除了具有下述取代的三种分子外的hIL-6的拮本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选ＩＬ－６的超激动剂、拮抗剂和超拮抗剂的方法，该方法包括以下步骤：－比较牛粒细胞集落刺激因子（ｂＧ－ＣＳＦ）和所述激素的氨基酸序列；和－在上述比较的基础上构建所述激素的三维模型，可通过该模型鉴别分别构成与特异受体相互作用的位点（位点１）和与ｇｐ１３０相互作用的位点（位点２）的残基。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：G希利博托，R萨维诺，A拉姆，C托尼亚逖，
申请(专利权)人：布安格莱荻公司分子生物学研究所，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]