样本的组群或子组群的选定方法技术

一种应用较重的密实粒子和重力沉积从生物样本中分离出选定的所需或不需组群的分离程序。粒子具有一个或多个反应剂连结在其上，该反应剂专门针对所选定的组群并容易与它连结。粒子与样本的混合最好是使粒子反复通过样本的相当大的部分进行沉积以便与选定的组群连结。然后最好使粒子和连结在其上的选定的组群在样本内沉积，包括非选定组群的上层清液可从粒子和连结着的选定组群上分开。粒子可以加热以便杀菌并清除内毒素。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般地涉及从样本中分离出所需或不需组群或子组群以便单独得到所需组群或子组群，或在一个或多个不需子组群从其中除去后得到一个强化组群或子组群的方法。更具体点说，本专利技术的目标是要分离出所需或不需组群或子组群，例如从骨髓或血液中分离出细胞，办法是将组群或子组群结合到较密实的粒子中，然后利用重力沉积将组群或子组群从其余的样本上层清液中分离出来。样本组群或子组群的强化可应用于多种用途。例如在有B细胞淋巴瘤的情况下，可能需要在骨髓中除去所有的非何杰金氏的B淋巴瘤细胞。如果骨髓要清除B细胞并重新输送给病人，那么要紧的是，骨髓必须完全净化，否则骨髓会受到损害。目前流行的一种方法是利用许多磁性的微球体，这些微球体通常是由具有较低密度的以聚合物为基的磁性材料制成。它们需要具有较低的密度，因为它们将与骨髓或血液混合在一起并且专门被设计为不会被重力沉积法沉积出来。这些微球体典型地具有较小的尺寸，一般直径约为或小于一微米。但美国纽约州Grest Neck的Dynal公司所销售的一种采用磁性聚合物微球体的产品，其公称直径为28或4.5微米，其较低的微球体密度约为1.5g/cc。现有技术的微球体要求在样本中维持悬浮状态，因此被设计成为在样本悬浮液中进行极其缓慢的或基本上消失的重力沉积。磁性微球体具有至少一个连结在其上的抗体专门针对所需除去的组群或子组群。通常，如在Dynal方法中，有一第一单克隆抗体连结到所关心的细胞并有一个专门针对第一单克隆抗体的第二抗体连结在微球体上。这些细胞在连结到单克隆抗体之前通常先从整个血液或骨髓中被分离出来然后被清洗，该清洗步骤不会对细胞造成可辨别的损失。微球体和细胞随后混合在一起并通过第一和第二抗体将微球体连结到细胞上。为了净化血液或骨髓，一个样本将和许多连结着微球体的抗体混合，然后被放置在一个磁场内。当微球体被保持在磁场内时，剩下的样本或上层清液即可除去。这道程序通常必须重复多次，因为单一的净化步骤往往不能把不需的组群或子组群排除到足够的百分比。净化的目标是要把所有的(100％)作为目标的组群或子组群都排除掉。这一点通常不能完全做到，此时只能尽可能地将样本净化到接近100％。磁性排除程序存在着若干问题。该程序在每一次进行排除步骤时也从其他组群中非特定地排除掉一些细胞。这将减少产出，即其余的所需组群所占的百分比。这时单一的排除步骤将产生一个百分比较低的可变的产出，每一个接续步骤也将减少产出。另外，磁性微球体是比较费钱的。磁性微球体程序也被用来强化子组群以便研究该子组群。在这种情况下，磁性微球体被连结到所需子组群上，而连结着细胞的微球体则从样本中被排除。这样子组群便可直接被研究或者可从微球体中除出来供研究。这个程序非常耗费时间，大约需要耗费一至六个小时或更长，并且可议论的是未能产生一个原来的子组群，这是因为子组群已有至少一个单克隆抗体连结到至少一种细胞抗原上。净化的另一用途是研究或强化一个特定的子组群，例如淋巴细胞(L)的CD4组群。在这种情况下，微球体具有专门针对一个或多个非CD4组群的单克隆抗体连结在其上。排除其他组群可提高样本的总共留下的细胞组群内的CD4细胞数。但当采用磁性微球体时，一部分CD4子组群的非特定的排除能够严重地影响到CD4子组群留下来的数目。当采用一个大体积的样本如为5ml或更大时，由于需要大量的磁性微球体，细胞的非特定的排除会带来更多的问题。当将磁性微球体放置在一个磁场内时，其他非目标的细胞的非特定的捕捉和排除带会发生。包括用抗体标记的表面在内的其它各种正面的或负面的选定方法都曾被应用以便从一个不同型式的细胞混合物中产生细胞的子组群。这些方法通常都有抗体共价地连结到一个柱管内的塑料表面或聚合物粒子上。一般地说，要使这个混合的细胞组群与连结的抗体结合起来，或是将它们加入到一个柱管中任它们培育或是使它们沉积在一个表面上。要使这些程序顺利进行，须先将红血球(RBC)和血浆从混合的细胞组群中除去，办法是通过密度梯度制备一个血沉棕黄色层或一个单细胞核的制剂，然后清洗细胞并使它们与用抗体标记的表面结合。这两种方法在使用前都还需要准备分离系统并用一缓冲剂冲洗，这样在采用柱管和烧瓶的方法时，连同与抗体培育的时间30至60分钟，整个程序需要至少三个小时。这些方法能够用来对所关心的细胞组群进行负面的或正面的选定。在这两种方法中，直接分离造成高浓缩的组群，同时非特定地造成非目标的细胞的损失。释出的细胞在其表面上可具有抗体，这些细胞常被分离技术激活，而这通常是不希望有的。实施本专利技术的方法和设备能够应用到各种免疫反应上，如含有反应剂和细胞的免疫反应。本文在使用时，细胞被定义为动物的或植物的细胞，包括细胞状的细菌和真菌，这些细胞可分开来或成为集合物予以辨认。细胞是有生命物质的最小的结构集合体，它能作为独立的单元而发挥其功能。例如，细胞可以是人体的组织、骨髓及/或血液的样本中的红血球(RBC)和白血球(WBC)组群、癌或其他不正常的细胞。适当加标志或标记的细胞当然可望像人体的血球或骨髓那样以相同的方式用本专利技术的方法和设备来进行操作。本文在使用时，术语“反应剂”被定义为各种分子，如单克隆或多克隆抗体，它们能够检测并与一个或多个在细胞表面上的特定的互补分子如抗原反应。下面给出一些实例反应剂特定分子抗体抗原药剂药剂受体激素激素受体生长素 生长素受体外源凝集素 碳水化合物分子核酸序列互补的核酸序列酶 余因子或抑制剂反应剂偶合或连结到细胞上的特定分子上。因此需要有一个有效的方法来清除或选出一个或多个子组群而不影响样本如全部血液和骨髓中的其余组群。这个方法应该是化费不多的、快速的、高收获率的并且对所要作用的样本的体积是没有限制的。本专利技术提供一种方法和设备可以用来从一个生物液体样本如全部血液中分离出一个所需或不需的组群或子组群，不仅快速而且具有高收获率。连结着一个或多个反应剂如单克隆或多克隆抗体的多个密实的、比较重的粒子与样本混合在一起。连结在粒子上的抗体可瞄准不感兴趣的细胞。通过重力使连结着细胞的粒子分化沉积，然后除去其余的样本。这样便可提高在样本中留下的关心细胞的数目，这种细胞是没有被粒子作为目标的。连结在粒子上的抗体也可瞄准关心的细胞。然后可将样本液体中的其余部分和非目标的细胞从连结着目标细胞的粒子中除去并分析确定除去了多少非目标细胞。然后再将目标细胞从粒子上取出以便进一步分析。一种较好的有价值的粒子材料可能是镍。镍粒子在需要时能够加热来使粒子成为无菌。如果样本已被净化并要移植到人体内，那么可用磁场和清洗程序来除去RBC并进一步确保所有的密实粒子都从样本中取出。下面对附图简要说明附图说明图1为按照本专利技术的选定方法的第一实施例的示意方块图；图2为按照本专利技术的连结着目标细胞的粒子的概念上的实施方案；图3A-3E为本专利技术的血袋混合器的前视、侧视和端视图；图4A和4B分别为按照本专利技术得到的全部血液控制和粒细胞富集的方形图；图5A和5B分别为按本专利技术得到的全部血液控制和淋巴细胞富集的方形图；图6A-6C为Rhon-Poulenc磁性粒子的重力沉积与本专利技术的密实粒子比较的方形图；图7A-7B分别为按本专利技术得到的全部血液控制和血小板或粒细胞已被排除的方形图；图8A-8C分别为按照本专利技术得到的全部血本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从液体样本中移走一个选定的组群或子组群的方法，该方法包括：备有多个密度大到足够施行分化重力沉积的粒子；所说粒子具有连结在其上专门针对至少一个预先选定的组群或子组群的反应剂；将所说样本的一部分与所说粒子混合，使所说粒子与所说预先选 定的组群或子组群连结而不显著有形地损害所说预先选定的组群或子组群；使所说粒子连同所说连结的组群或子组群在所说样本部分内进行分化重力沉积；及将含有所说非选定的组群或子组群的所说样本部分的所得到的上层清液的至少一部分从所说粒子和所说连结 在组群或子组群上分离开来。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：华莱士H科特，罗伯特K兹沃纳，罗伯特J施米特林，托马斯R拉塞尔，
申请(专利权)人：库特国际公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]