在凝胶过滤介质上连接进行重复固相析出的分离纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种全新而基本的分离纯化方法，适合多种物质的沉淀与结晶分离纯化过程。该方法通过将一定体积的固相析出溶液或溶剂流入适当的凝胶过滤层析系统，再上样洗脱，实现了连续重复的固相析出分离纯化过程。本方法的特点是分辨率高，上样量大，损失小，操作简便，适用面极广，可以使一系列的沉淀、结晶的分离纯化方法和工艺得到明显改进，具有很大的应用推广价值，尤其适合于实验室制备与工业化生产。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种全新的分离纯化方法，适用于多种物质的分离纯化，可以把一大类基本的分离纯化方法——液体溶液中的固相析出法提高到一个新水平。固相析出法，包括沉淀法和结晶法，是一种非常基本的分离纯化方法。它是根据不同物质在同一溶液中溶解度不同，在固液两相分配的量不同进行分离的。操作上，使不同的物质在处于一定条件的溶液中发生固相析出，形成沉淀或结晶，然后用自然沉降、过滤或离心技术分离固液两相。固相析出法具有简单、经济、处理量大、适应面广、浓缩倍数高的优点，广泛应用于各种物质的分离纯化过程中，在化学、化工、生物工程、生化、医学、制药、食品等众多学科与产业的分离纯化工作中，起非常重要的作用。固相析出法一般一次就可除去大量杂质，但为提高产品纯度，常需进行重复操作，如有机小分子物质和无机物常用重结晶方法，蛋白质分离常可用重复盐析等。重复固相析出法会明显改善分离效果，但因为单元操作体积和装置的接触面积不可能太小，造成损失大、收率低；又因重复析出一般是断续操作，步骤多而操作麻烦，实际应用中，重复析出的次数不可能过多，一般只重复两到三次；所以重复固相析出法在应用上受到严重的限制。迄今为止，人们已设计出几种连续重复固相析出装置，但应用面都很窄，效率也不高。如工业上应用的连续多级结晶器，用温度梯度实现重复结晶，固液分离靠螺旋刮刀等分离不彻底，效率较低。在聚合物的淋洗分级装置中，也有一种连续重复沉淀的设计，通过温度梯度，使溶解了的沉淀又重新沉淀，沉淀物与溶液分离靠的是玻璃砂、铝箔等物质，固液分离也不彻底，效率不高。Schwimmer在1953年(S.Schwimmer，Nature，1953，171，442)曾用过如下方法把CaSO4·1/2H2O介质填装在玻璃柱中，将含蛋白质的硫酸铵溶液流经柱体，介质的水合作用增加了盐的浓度，造成蛋白质的盐析，因溶液向前流动，盐浓度逐渐增高，可能造成反复沉淀。但此法条件很难控制，效率也不高。已知的重复固相析出装置，都有应用面窄、装置较复杂、固液分离不彻底、效率低、操作条件较难控制的缺点，至今还没有一种较好的连续重复固相析出法广泛应用。本专利技术的目的专利技术一种全新的，在凝胶过滤介质上连续进行重复固相析出的方法，它分辨率高、回收率大、上样量大、设备简单、装置可以反复使用并适用于多种析出方法。本专利技术的基本要点是本专利技术应用以下两点原理首先，在凝胶过滤层析中，小分子迁移慢，大分子迁移快，其次，一定范围大小的固体颗粒介质(一般大于5μm、小于50μm)可以充当助滤剂，拦阻固相析出物，起到过滤的作用，并提供高的流率。而一定细度的凝胶过滤介质可以起助滤剂作用。本专利技术利用第一点实现重复固相析出，利用第二点实现彻底的固液分离。实施本专利技术的条件固相析出剂的分子量比被析出物的分子量要小，使得二者在凝胶过滤介质上，迁移时，有较明显的速率差异。操作上，选择适当排阻范围和工作范围的，一定细度的凝胶过滤介质，填装在层析柱内，或铺成板准备层析，先将能使被分离物发生固相析出的溶液(称做析出剂或析出)流入柱或板内，达到一定体积，再将被分离物质以固相或溶解相上样，然后通入能使被分离物溶解的溶液或溶剂(称为溶解液或溶解剂)进行洗脱，以上装柱或铺板及上样洗脱的操作同于一般的层析操作。样品被溶解剂洗脱后，被分离物质分子以溶解状态迁移，迁移速率比前面的析出剂分子速率快，所以会逐渐赶上并相遇，进入析出剂里发生固相析出，析出物即被作为助滤剂的凝胶过滤介质过滤拦阻，而溶液中不析出的物质继续以原速率快速迁移，这样发生第一次固相析出分离。析出物被拦阻后，停止不动，当后续的溶解剂流过时，又重新溶解，以大的迁移速率追赶析出剂，重复析出，析出物又被拦阻，发生第二次固相析出分离，如此反复，只要层析柱或板有足够的长度，使以上的追赶过程实现，就可以继续重复。这样，就可以实现连续而多次重复的固相析出分离，直至被分离物流出柱或板为止。以上所说的一定排阻范围，是指能使析出剂分子与被分离样品分子的迁移速率的有明显差别，而且差别越大越好，最好是析出剂完全渗透，样品分子完全排阻。比如在等电点沉淀蛋白质，一定pH值的缓冲液的分子属小分子，如NaAc-HAc缓冲液，而蛋白质分子分子量大于一万，所以用葡聚糖凝胶G-10，G-15，G-25，都可以满足最好的排阻范围要求。一定的细度指的是能够较好地拦阻析出物使固液分离彻底又有较好的流速，一般中粒或更小颗粒的凝胶过滤介质就可以较好地拦阻析出物。一定的工作范围，指在析出剂、溶解剂和样品溶液中介质操作性能良好。凝胶过滤层析技术又称分子排阻层析，凝胶渗透层析，作为一种通用性的分离技术已广泛应用，其介质也不断推陈出新，有多种商品可供选择；如控孔玻璃微珠(Bio-glass)系列，葡聚糖(Sephadex)系列，琼脂糖(Bio-GelA、Sepharose)系列，聚丙烯酰胺(Bio-GelP)系列，聚合烯丙基葡聚糖(Sephacryl)系列、聚乙烯醇(Toyopearl)系列等，其分子排阻范围从百到数百万道尔顿，其粒度一般都有粗、中、细、超细四个等级，除粗粒外，中、细、超细胶作为助滤剂的性能很好，可以快速地过滤一般的固相析出物。工作范围也较宽，在水溶液操作性能良好，许多凝胶如Sephacryl，Toyopearl，可以在有机溶剂中操作，并可耐受一定强度的酸碱，机械生能与流速也非常好，总之，现代凝胶过滤层析技术已能为本专利技术提供多种排阻范围，细度和工作范围的凝胶，为本专利技术的可行性提供了充分的保证。本专利技术可以很方便地在现有的层析装置上实施。同一般层析技术相似，可以采用阶段洗脱、梯度洗脱方式，也可以在一个柱上实现多种方式的不同机制的固相析出方法的连续重复操作。阶段洗脱方式先在层析柱或板内流入析出液，然后上样， 再分别用不同强度的溶解剂分别按阶段进行洗脱。梯度洗脱方式使析出液与样品同于阶段洗脱方式流入层析系统，而溶解剂则按梯度方式逐渐增强溶解生能。这种洗脱方式，会使样品得到一个连续的，分辨力更好的分级效果，在流出液中不同的物质将会有一个较窄的分布。如果我们在层析系统中先流入一种析出方式的析出剂达一定体积，然后再流入另一种析出方式的析出剂达一定体积，两种析出剂的迁移速率相等或相近而不能相互混合干扰，而其体积不能太大，要让样品物质的速率能从后面追上来并发生一定次数的反复析出，那么我们就可以在一个柱或板上，实现两种析出方式的连续重复分离。本专利技术所指的固相析出剂不一定是特定的沉淀剂，只要在某一溶液或溶剂中溶解度小，有析出就可以，甚至可以用蒸馏水等。本专利技术将固相析出分离原理与凝胶过滤层析原理结合起来，创造了一种全新的连续重复固相析出技术，可简称“固相析出层析”，它与现有技术相比，有以下优点1.上样量大、分辨率高、回收率较好。可以将固相析出分离方法引入一个新水平。因为采用助滤剂过滤方法在介质上阻留析出物，不同与一般层析技术的保留机制，所以其上样量可以大于任何一种已知的层析技术而没有固定相吸附或分配等过程中所出现的饱合限制；因为是多次连续重复析出且固液分离彻底，故比一般的析出分离法分辨力高出许多；因本专利技术的固液分离机制特殊，其单元操作体积小、故回收率较好。2.操作简单，实施容易方便，与现有的层析设备兼容，介质可以反复使用，每次用后不需要再生，比其它本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在凝胶过滤介质上连续进行重复固相析出的分离纯化方法，其特征在于选择适当排阻范围和工作范围的，一定细度的凝胶过滤介质，填装在层析系统内，先将能使被分离物发生固相析出的溶液或溶剂（称做析出液或析出剂）流入系统内，达到一定体积，再将被分离物质以固相或溶解相上样，然后通入能使被分离物溶解的溶液或溶剂（称为溶解液或溶解剂）进行洗脱。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄潮，
申请(专利权)人：黄潮，
类型：发明
国别省市：21[中国|辽宁]