利用9、10-二氢化吖啶的水解酶的化学发光检测制造技术

本发明专利技术描述了一种化学发光检测方法，组合物和试剂盒。其中使用了一种被护苯酚增强化合物，这种化合物被一种水解酶去保护，从而增强光化学反应。这一反应涉及一种９、１０－二氢化吖啶化合物，优选为Ｎ－烷基－（９、１０－二氢化吖啶）－９－羧酸的衍生物，在去保护增强子存在时，它能被过氧化物和过氧化物酶激活而发光。结果是增强了发光。水解酶单独存在或与免疫检测、ＤＮＡ探针检测或其他检测中特殊的结合对的链节连接，其中这些水解酶与信息分子结合。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是于1994年3月2日提出的申请系列NO.08/205,093和1994年4月15日提出的NO.08/228,290的连续部分，其中NO.08/205,093和NO.08/228,290为1993年5月17日提出的申请系列NO.08/061,810的连续部分。本专利技术的领域本专利技术涉及到一种改进的用化学方法产生光(化学发光)的方法，其中通过一种酶的作用产生一种促进过氧化物酶的反应性能的物质，而该过氧化物酶本身又催化化学发光反应。本专利技术也涉及应用这一方法来检测第一种酶。本专利技术还涉及应用这一方法来分别检测和测量各种生物分子，包括利用免疫检测技术的半抗原、抗原和抗体，利用Western-印迹技术的蛋白质以及利用Sourthern和Northern-印迹技术的DNA和RNA。这一方法也被用来在DNA测序应用中检测DAN。这一方法还可被用来检测DAN突变。有关技术描述(a)10-甲基-(9、10)-二氢化吖啶-9-羧酸的烷基酯和芳香酯在强碱条件下在偶极非质子传递溶剂中通过自氧化形成N-甲基吖啶酮而产生化学发光(F.McCapra，“美国化学研究报告”(Acc.Chem.Res.)9(6)，201-8(1976))。化学发光的量子产额在10-5-0.1的范围内，据发现在酚和醇的离去基团的pKa下降时其量子产额会增加。由于中间介质的竞争性的不发光的分解，在水溶液中量子产额会非常低。加入阳离子表面活性剂CTAB，通过阻止竞争性的黑暗反应能增加130倍的表现量子产额。申请人的同时待审查的申请系列1993年5月17日提出的NO.08/061,810，1994年3月2日提出的NO.08/205,093以及1994年4月15日提出的NO.08/228,290公开了用于检测过氧化物酶和辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光的9、10-二氢化吖啶化合物。除申请人的前述的同时待审查的申请外，没有其他任何靠利用过氧化物酶或其他酶氧化9、10-二氢化吖啶来产生化学发光的报导。(b)增强酶的方案颁发给Kricka的美国专利5,306,621描述了一种用酶法从无活性前增强子(pro-enhancer)产生用于辣根过氧化物酶(HRP)催化的氨基苯二酰一肼的化学发光的氧化反应的增强子的方法。没有任何关于将9、10-二氢化吖啶用作化学发光的底物的建议。所报导的这一方法的相对低的灵敏度(10-16mol碱性磷酸酶)对于很多应用都是不够的。已报导过用于碱性磷酸酶比色检测的偶联酶的阶式反应器(D.M.Obzansky等人“临床化学”(Clin.Chem.)，37，1513-8(1991))。在这个方案中，碱性磷酸酶产生一种与第二种酶的无活性形式起反应并将这种酶转化为活性状态的物质。第二种酶与其自身的底物反应产生H2O2。以随后的比色方法来检测H2O2。但关于化学发光检测未作任何披露和建议。曾报导一种化学发光的Western印迹方法，其中结合的HRP-抗体共轭物催化一种引起膜表面生物素-酚共轭物沉淀的反应。结合的生物素用于俘获额外的HRP-抗生蛋白链菌素共轭物。被俘获的酶通过氨基苯二酰一肼的化学发光来检测(D.A.Wigle，N.N.Radakovic，S.L.Venance，S.C.Pang“生物技术”(BioTechniques 14，562-3(1993))。对利用9、10-二氢化吖啶作为化学发光的底物未作任何披露和建议。已经知道有几种涉及多酶的生物发光和化学发光的反应(A.Tsuji，M.Maeda，H.Arakawa，“分析科学”(Anal.Sci.)，5，497-506(1989))。对作用方式的仔细研究发现，与本专利技术相比，在这些方法的大多数中，仅有一个增强阶段。所有后来的阶段仅仅为达到最后的发光反应提供一个电子传递体系(electron relay system)。只有以利用碱性磷酸酶产生NADP+为基础的比色方法才确实为双重增强的方法(A.Johannsson，C.J.Stanley，C.H.Self，“临床化学杂志”(Clin.Chim.Acta)148，119-24(1985))。已知还有一种基于同样原理的荧光分析(D.B.Cook，C.H.Self，“临床化学”(Clin.Chem.)，39，965-71(1993))。没有讲授或建议利用化学发光的参考资料。附图说明图1是利用本专利技术的试剂组合物检测碱性磷酸酶(AP)的线性曲线。含有被保护的HR的增强子磷酸2-萘酯的溶液和标量的AP保温。在37℃下30分钟的原初反应阶段后，加入50μl保持在室温下的本专利技术的试剂。该试剂含有0.1mM 2′、3′、6′-三氟苯基-3-甲氧基-10-甲基-(9、10)-二氢化吖啶-9-羧酸酯(2′、3′、6′-trifluorophenyl-3-methoxy-10-methylacridan-9-carboxylate)，1.2mM过氧化脲，2mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.05％吐温20(TWEEN 20)和40pmol HRP。在15分钟时测光强。术语S-B是指存在AP时的继电器逻辑元件(RLU)中的化学发光信号(S)，其中(S)以无AP时背景化学发光(B)来校正。以这一方法，0.1amol(1×10-19mol)的AP都可以检测到。图2是利用本专利技术的试剂组合物检测β-半乳糖苷酶(β-Gal)的线性曲线。在0.005M磷酸钠缓冲液pH7.0中含有被保护的HRP增强子p-苯基苯酚-半乳糖苷的溶液和标量的β-Gal于室温下保温。在30(min)的原初反应阶段后，加入50μl保持于室温的检测试剂。该试剂含有0.1mM 2′、3′、6′-三氟苯基-3-甲氧基-10-甲基(9、10)-二氢化吖啶-9-羧酸酯，1.2mM过氧化脲，2mM EDTA，0.05％ TWEEN 20和40pmol的pH8.0的0.01M tris-缓冲液中的HRP。在15分钟时测量光强。以这一方法，0.56amol(5.6×10-19mol)的β-Gal也是可以检测的。因此本专利技术的一个目的是提供一种利用被护增强子通过过氧化物酶作用产生化学发光来检测水解酶以及其共轭物的方法。本专利技术的另一目的是提供一种利用被护增强子通过过氧化物酶的作用产生化学发光来检测生物物质和化合物的方法。此检测可以采取溶液中的免疫检定、Western-印迹技术中的蛋白质的检测、和Sourthern-印迹技术中或DNA测序应用的DNA的检测以及其他(例如突变的检测)DNA杂交分析等形式。本专利技术涉及一种用于产生化学发光的方法。这一方法包括使一种被护增强化合物与第一种酶反应产生一种增强化合物，该增强化合物促进9、10-二氢化吖啶化合物(优选N-烷基-(9、10)-二氢化吖啶-羧酸的衍生物)和过氧化物与过氧化物酶反应产生化学发光。在一个优选方案中，第一种酶为一种水解酶。优选的9、10-二氢化吖啶化合物的分子式为 其中，R选自烷基、杂烷基和芳烷基，R1-R8单独选自于产生光的基团，其中Y为一个离去基团，它能通过9、10-二氢化吖啶与过氧化物和过氧化物酶反应而产生光。本专利技术也涉及利用此方法通过化学发光反应在某一检测过程检测被分析物，其中被分析物被连结到或者能够直接地或间接地被连结到第一种酶上，并且其中产生的光的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于产生化学发光的方法，该方法包括使一种水解酶与一种被护增强子、一种过氧化物、一种过氧化物酶以及一种９、１０－二氢化吖啶的化合物起反应，该９、１０－二氢化吖啶化合物与过氧化物和过氧化酶反应产生光，其中被护增强化合物分子式为ＡｒＯＸ，其中Ｘ为一个与水解酶反应的离去基团，Ａｒ选自取代的苯基、萘基和取代的萘基，其中水解酶与被护增强化合物反应以除去Ｘ，因而，与无增强化合物时产生的光水平相比较，增加了９、１０－二氢化吖啶化合物产生的光的水平。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：哈谢姆阿克哈温塔夫蒂，扎拉阿戈哈瓦尼，雷努卡德席尔瓦，
申请(专利权)人：鲁米根公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]