9,10-二氢化吖啶化合物发光的新方法和试剂盒技术

本文公开了采用两步化学发光反应的化学发光测试方法、组合物、试剂盒和化学发光的９，１０－二氢化吖啶化合物。该反应包括９，１０－二氢化吖啶化合物，优选Ｎ－烷基－９，１０－二氢化吖啶－９－羧酸，在使得中间体化合物能积累的时间、温度和ｐＨ条件下，与过氧化物、过氧化物酶和增强剂进行反应，随后通过提高ｐＨ诱发突然发光。结果是通过这一反应产生极高强度的光。在免疫测试、ＤＮＡ探针测试或其它凡是水解酶与受体分子结合的测试中，该过氧化物酶是单独存在或与一种特定结合对的一个成员相连的。由于孵育和发光步骤的分离，因而这一方法特别适用于自动测试。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
交叉引用的相关申请本申请是申请人的两件共同待审申请08/205,093(1994年3月2日提出)和08/228,290(1994年4月15日提出)的部分继续申请，这两件申请又是申请号为08/061，810(1993年5月17日)的部分继续申请。专利技术背景(1)专利
本专利技术涉及化学发光的9，10-二氢化吖啶化合物，更具体的说，涉及N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸衍生物，它们可由9，10-二氢化吖啶通过与过氧化物和过氧化物酶反应而发光(化学发光)。本专利技术涉及由化学方法发光(化学发光)的一种改进的方法，该方法是通过一种过氧化物酶和一种氧化剂(如过氧化氢)对一组N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸衍生物的作用而实现的。本专利技术也涉及用特定的增强剂物质使得该方法产生的化学发光量增加的改进方法。本专利技术也涉及用该方法测定过氧化氢或过氧化物酶。而且，本专利技术还涉及用该方法监测和定量测定多种生物分子。例如，该方法通过免疫试验技术可用来测定半抗原、抗原、蛋白质和抗体，以及通过核酸杂交试验可用来测定DNA或RNA。该方法另外还可用于检测可产生过氧化氢的酶如氧化物酶。该方法特别可在用自动化仪器完成的试验中检测生物分子。(2)相关技术的描述通过采用放射标记的报道分子，过去已能够以很高的灵敏度完成对生物分子的检测和定量测定。最近已发展了无数非放射活性的方法以避免采用这些(放射性)物质带来的危害和不便。酶联检测技术提供了最好的灵敏度，这是因为底物的催化转化产生了可检测的变化，实际上放大了被测信号。现已开发了一些可产生颜色、莹光或化学发光的底物，后者可获得最好的灵敏度。而且，试验灵敏度的增加会扩展以化学发光为基础的方法的应用范围，这是由于可以用更少量的分析物来进行测定或者由于降低了完成试验所需的时间和/或反应物的量。在化学发光试验中提高测定速度和灵敏度的一种方法就是使得所发的光是短脉冲、高强度的光。在酶联检测方法如免疫试验、寡核苷酸检测和核酸杂交技术中，辣根过氧化物酶(HRP)是最广泛使用的酶之一。本领域已知的HRP检测的化学发光试剂在分析中并未完全利用该酶的生物性能，这主要是由于灵敏度的限制。因此，需要更有效的化学发光底物以改善该报道酶的可用性。此外，产生高强度闪光与酶催放大步骤结合的能力(这是本领域未知的)，对检测灵敏度和自动测定也有有益的作用。a.9，10-二氢化吖啶的氧化在共同申请系列号08/061,810(1993年5月17日提出)，08/205,093(1994年3月2日提出)和08/228,290(1994年4月15日提出)中，公开了用过氧化物酶使取代和未取代的N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸衍生物氧化而产生化学发光。这些专利公开的内容在此作为参考文献引用。在过氧化物酶和过氧化物存在下，可以在一步反应中有效地氧化N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸衍生物而产生N-烷基吖啶酮和化学蓝光。在偶极非质子溶剂强碱性条件下，10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯经过自动氧化产生化学发光(F.McCapra，Acc.Chem.Res.，9(6)，201-8(1976)；F.McCapra，M.Roth，D.Hysert，K.A.Zaklika“化学发光和生物发光”，plenum press，New York，1973，pp.313-321；F.McCapra，“有机化学进展”，8，231-277(1971)；F.McCapra，“纯应用化学”，24，611-629(1970)；U.S.Patent NO.5,283,334 and 5,284,951toMc Capra and 5,284,952 to Ramakrishnan)。产生的化学发光的量是在10-5至0.1范围内，并且发现当苯酚或醇离去基团的Pka减小时，该发光量增加。在水溶液中产生的量明显较低，这是由于中间体的竞争性非发光分解反应的存在。加入阳离子表面活性剂CTAB由于阻止了不可见(光)反应而使产生的可见光增加130倍。b.吖啶鎓酯的化学发光氧化在碱性溶液中采用H2O2对N-烷基吖啶鎓羧酸的脂族和芳族酯进行化学发光氧化反应是众所周知的反应。接近0.1的高化学发光量使具有可结合生物分子侧活性基的衍生物得到了发展。利用吖啶鎓酯标记的许多化学发光免疫试验和寡核苷酸探针已有报道。吖啶鎓酯(AE′s)的采用，特别是当在蛋白质或寡核苷酸上标记时，有两个缺点。主要问题是水解稳定性。在室温或略高于室温条件下，通过酯基的水解，吖啶鎓酯共轭物发生稳定的分解。根据离去基团的取代情况，需要在-20℃下长期保存。当在这些条件下氧化时，N-烷基吖啶鎓羧酸的酰胺、硫代酯和磺酰胺也可发光(T.Kinkel，H.Lubbers，E.Schmidt，P.Molz，H.J.Skrzipczyk，生物发光和化学发光杂志(J.Biolumin.Chemilumin.)，4，136-139，(1989)，G.Zomer，J.F.C.Stavenuiter，Anal.Chim.Acta，227，11-19(1989))。这些改性的离去基团只能部分地改善保存稳定性。吖啶鎓酯的第二个缺点是在9-位加合亲核试剂(如水)有生成不发光的假碱中间体的趋势，该假碱中间体在黑暗中以pH依赖的方式分解。在实践中，首先必须降低吖啶鎓酯溶液的pH以使假碱的生成反应反方向进行，然后在H2O2存在下升高pH使其发光。采用吖啶鎓酯作为化学发光标记的-个更主要的局限在于下述事实当用作直接标记时，至多只有约10个分子可结合到蛋白质或寡核苷酸上。与有效产生光子的光量(≤10％)相对应，吖啶鎓酯标记的被分析物至多产生一个光子。与此相对照，通过化学发光反应检测的酶标记的被分析物，利用酶的催化作用对每个被测分析物分子而言可能产生多达几个数量级的光。在免疫试验中增加与被分析物结合的吖啶鎓酯分子数量的一种尝试就是建立抗体-脂质体结合物，其中的脂质体含有不定数量的AE′s(S.-J.Law，T.Miller，U.Piran，C.Klukas，S.Chang，J.Unger，J..Biolumin.Chemilumin.，4，88-98，(1989))。这种方法与采用直接标记的AE′s相比只能使信号有中等程度增加。c.辣根过氧化物酶的化学发光检测氨基取代的环酰基酰肼如氨基苯二酰-肼和异氨基苯二酰-肼与H2O2和过氧化物酶酶催化剂(如辣根过氧化物酶，HRP)在碱性条件下反应伴随着发光。该反应是测定H2O2和过氧化物酶分析方法的基础。在采用HRP的强化化学发光试验中已经使用了氨基苯二酰-肼的类似物(8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并哒嗪-1，4-(2H，3H)二酮)(M.Ii，H.Yoshida，Y.Aramaki，H.Masuya，T.Hada，M.Terada，M.Hatanaka，Y.Ichimori，Biochem.Biophys.Res.comm，193(2)，540-5(1993))。被过氧化物酶和过氧化物氧化的另外的化学发光化合物是羟基取代的邻苯二甲酰肼(Akhavan-Tafti，共同待审的US专利申请号965231，1992年10月23日提出)。申请人共同申请，申请号08/061,810，08/205,093和08/228,29本文档来自技高网...

【技术保护点】
产生化学发光的方法，该方法包括：ａ）在中间体化合物能积累的时间、温度和第一个ｐＨ水平的条件下，使过氧化物和过氧化物酶与９，１０－二氢化吖啶反应；和ｂ）将ｐＨ提高至足以使该中间体与过氧化物的反应能突然发光的第二个ｐＨ水平，其发光强度基 本上大于该ｐＨ提高前产生的强度。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：哈希姆阿克哈文塔夫蒂，扎拉阿格哈瓦尼，伦纳卡德席尔瓦，
申请(专利权)人：鲁米根公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]