抗体生产的检测制造技术

一种检测血液样品中与靶抗原反应的主动抗体生产的方法，所说的方法包含： ａ）在蛋白质合成抑制剂存在和不存在时，在允许淋巴细胞生产和分泌抗体的条件下将所说样品，或另选直接从所说样品中分离的淋巴细胞的等份试样与固相接触； ｂ）检测溶液中与固相上所说抗原结合的抗体；及 ｃ）比较在蛋白质合成抑制剂存在或不存在时所说的抗体结合，从而获得与所说抗原反应的主动抗体分泌的测定量。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗体生产的检测，特别是涉及借助于修改的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测与感染或接种等反应时血液样品中的主动抗体合成。ELISA长期用于检测和测定抗体(或抗原)。最常见的是，ELISA用作血清学试验，但也用于研究抗原或抗体的免疫化学特征，例如，经常发现将它应用于评价和鉴定免疫反应，在杂交瘤技术等中经细胞培养研究抗体生产。由于其灵敏性，简单性及操作的简便和快速，该技术已广泛用作诊断工具且现在常规用于临床实验室以检测感染或接种后血清或血浆中抗感染原的抗体。因此，例如，HIV感染的许多试验取决于使用常规ELISA试验检测血清或血浆中抗该病毒的抗体。然而，由于这种简单的血清学ELISA试验仅仅测量了样品中靶抗体的存在，它不能区分与抗原反应的进行中的抗体合成与感染后或经被动传递等已经存在的抗体。同时在有些情况下，可足以简单地获得关于抗体存在的信息，在其它情况下需要能确定检测的靶抗体是否是在试验时，例如在接种过程中或在婴儿感染的诊断中由淋巴细胞急性合成的以区别被动传递的母体抗体。这在传统的ELISA方法中不能实现。因此已建立了其它方法，使得能够检测进行中的抗体合成。可具体提及的有酶联免疫斑点(ELISPOT)试验(也称为斑点ELISA或ELISA斑点试验)，例如由Czerkinsky等在《ELISA和其它固相免疫试验》，D.M.Kenneny和S.J.Challacomb编辑，1988，第10章217-239中所作的综述。基于ELISA方法，该技术能计数分泌抗一种或多种靶抗原的抗体的淋巴细胞。ELISPOT基本上是ELISA方法的一种变化，其中经过培养在用靶抗原覆盖的特别修饰的ELISA孔中的淋巴细胞并经过用在分泌细胞周围产生有色沉淀(斑点)的酶底物复合物取代标准ELISA试剂显示分泌抗体的细胞(ASC)。然后计数斑点得到生产抗体的细胞数测量值。在体外培养期间，蛋白质合成抑制剂可包含于培养基中以证实检测到的斑点是由于从头抗体合成引起。已证实ELISPOT技术在研究体液免疫反应的动态中非常有用，且已用于检测免疫过的受试者外周循环中瞬时出现的自发ASC，该方法的某些特征限制了其在临床诊断情况中的应用。首先，由于对每个样品需要计数单独的斑点，这是费时且费力的，因此该方法不特别适合于分析大量的样品，如在临床诊断实验室中的样品。第二，在每个样品中仅计数分泌抗体的细胞数，一般来说，这需要合理大小的样品体积例如，几毫升。ELISPOT板也较昂贵且该试验不易于自动化。由此可见，尽管在抗体检测技术上有进展，但仍需要一种简单，快速且实施时花费有效的试验，它能可信地精确定量自发分泌的抗体，能区分从头抗体合成，特别是能在血液样品上实施以达到诊断目的。本专利技术阐述了该需要。因此，在一个方面，本专利技术提供了一种在血液样品中检测与靶抗原反应的主动抗体生产的方法，所说的方法包括在蛋白质合成抑制剂存在和不存在时，在允许淋巴细胞生产和分泌抗体的条件下，将所说的样品或另选从所说样品中直接分离的淋巴细胞的等分试样与固相接触；检测溶液中与固相上所说的抗原结合的抗体；及在蛋白质合成抑制剂存在或不存时比较所说的抗体结合，从而获得与所说的抗原反应的主动抗体分泌的测定量。本文使用的“主动抗体生产”指由样品中淋巴细胞生产的自发分泌的抗体，该淋巴细胞在试验过程中作为主动进行免疫反应的结果而主动产生抗体。在所有情况下该抗体指本专利技术的试验方法前或期间存在于体内但不存在于体外的抗原。本文使用的短语“与所说抗原反应的主动抗体分泌”试图指与在该试验中使用的抗原结合的主动分泌的抗体，尽管使用的抗原可以不是开始刺激免疫反应的免疫原。因此，该试验中所用的抗原和在体内已刺激和正刺激抗体生产的免液原由于其相同或非常相似的抗原决定簇可能都结合待检测的抗体，在其它方面抗原和免疫原可以是不相同的。因此，本专利技术的方法中使用的抗原可以是含有相关免疫原全部或一些部分的物质，例如，来自感染的个体，或从相同或相似材料纯化的部分，同样抗原可经合成来制备，例如，经化学合成或重组表达比天然抗原增加或缺少部分的抗原。因此，可使用融合蛋白质或仅表达合适抗原决定基(或簇)的分子。一般来说，本专利技术的方法涉及在允许淋巴细胞产生和分泌抗体的条件下培养与合适的固体表面接触的血液样品中的淋巴细胞以固定待检测的抗体，然后回收细胞，并检测抗体与固相上抗原的结合。经过比较在蛋白质合成抑制剂存在或不存在时检测的抗体结合水平，可区分和定量从头抗体合成。令人惊奇的是，本专利技术的方法允许使用较小的血液样品体积(例如，μl体积，不超过1ml)，直接检测未刺激的淋巴细胞的自发抗体生产，而不用在与固相培养前预培养淋巴细胞的前面步骤。换句话说，样品的淋巴细胞直接用于本专利技术的试验方法而不经过任何预处理或刺激，例如，经抗原体外刺激。从而可检测取样时淋巴细胞分泌的抗体。以这种方式，即使使用这种较小的样品体积，也能具有优势地将与试验抗原反应的自发进行的抗体合成与淋巴细胞的旁观者激活区分开。也分析了不刺激细胞引起任何记忆时它们自发分泌抗体的情况下的淋巴细胞。这与其它所公开的利用体外抗原刺激以增强试验灵敏性的方法成对比。另一方面，本专利技术利用自发抗体分泌允许检测指示试验抗原正在进行的感染的血液中的抗体；在感染或接种等后的前几周，血浆淋巴细胞分泌抗试验抗原的抗体。以本专利技术的方法检测该抗体使人们能够诊断或测定该感染或监测与接种反应的抗体等。这在婴儿和新生儿中特别有用，其中区分新合成的抗体与被动传递的母体抗体是重要的。可在分开的试验中或在使用多个相关抗原的相同试验中分析相同的血液样品中抗一些不同的感染原的抗体。从而允许使用与病人存在的临床症状一致的有关接触抗原。在诊断感染中，区分正在进行的抗体合成与因以前感染已经存在的抗体也是重要的。经体外抗原刺激引起免疫记忆与试图鉴定正在进行的急性感染的试验不一致，因此以前基于抗原刺激的方法不具有这种优势。另外，包括抗原刺激的步骤可能减少本专利技术的试验的有利性时间因素，与
技术介绍
的方法相比，本专利技术的方法操作非常快。根据本专利技术的方法检测的抗体所针对的抗原包括细菌和病毒抗原。临床上重要的抗原包括但不限于来自诸如单纯疱疹病毒，巨细胞病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)和任一肝炎病毒的抗原。该抗原的检测可用于迅速确定病人是否被感染，例如用于血液筛选目的或用于确定和/或监测感染。由于其简单性，该方法特别有用，且当不能得到复杂的设备时，例如在野外情况下可使用。本文使用的术语“检测”和“测定其量”包括抗体生产水平的定量和定性测定，其意义为获得样品中所产生的抗体总量的绝对值，也包括抗体生产水平的指数，比率，百分数或相似指标以及半定量或定性测量。本专利技术的主要优势是仅需要较小的样品体积，例如50-500μl，优选100-300μl，且通常是100-200μl血液或可与全血来源体积相比的血产物，它与一般依赖几毫升体积血清的传统诊断试验成对比。这在从新生儿取血样的情况中特别有用，因为本专利技术的方法仅需要μl体积。可直接使用血液样品，一般是外周血液样品，尽管可优选首先从样品中分离淋巴细胞。这可使用本领域熟知的标准技术进行。因此，例如，可常规使用各种全血制品，如加有肝素的血液，加有EDTA的血液等，如临床实验室所常规制备的。尽管不是必需的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：L·R·哈海姆，
申请(专利权)人：L·R·哈海姆，
类型：发明
国别省市：