一种微载体检测抑制物的测定方法技术

本发明专利技术涉及植物病理学技术，具体是公开了一种采用凹玻片制备25μl的琼脂培养基微载体，在微载体上载入药物样品以及病原菌孢子，检测药物对孢子萌发的抑制作用，测定方法的步骤如下：1)制备合格的微载体；2)将待测样品载入微载体；3)滴入病原菌孢子；4)孢子萌发培养；5)结果观测。本发明专利技术的优点：1)可在一个平皿上测试多个样品，实现测试体系小型化；2)一个测试单元只消耗样品液10μl，实现检测样本微量化。

【技术实现步骤摘要】
一种微载体检测抑制物的测定方法
本专利技术涉及植物病理学技术，具体是一种微载体检测抑制物的测定方法。技术背景当前及今后相当长时期内，农药防治仍是植物病害防治的主要手段。探索和挖掘生物源农药是农药防治的重要方向，而生物源农药的早期探索挖掘往往要从自然界中采集或收集对植物病原菌具有抑制作用的物质，或者从生物体或生物产品中分离具有抑制作用的活性成分。显然，高效可行的抑制物识别检测手段将有利于提高生物源农药探索挖掘的成效和效率。当前识别抑制物对病原菌作用的常用方法包括利用琼脂培养基平板的测定方法，该测定方法的主要技术思想是，利用普通平皿制备含药培养平板，再接种入病原菌，然后培养观察药物对病原菌的抑制作用。该测定技术方案往往要求待测样本的样品量比较大，样品量过少时往往无法检测，容易错过或遗漏含量少的抑制活性物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用微载体技术检测有关物质对孢子萌发的抑制作用的测定方法。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种微载体检测抑制物的测定方法，主要技术是利用凹玻片制备25μl的琼脂培养基微载体，在微载体上载入药物样品以及病原菌孢子，检测药物对孢子萌发的抑制作用，测定方法的步骤如下：1.制备合格的微载体1)凹玻片的灭菌：将洁净的凹玻片进行高温灭菌后备用。2)凹玻片的摆置：预先准备能容纳保湿材料和凹玻片的保湿器具，在无菌工作台上打开保湿器具的盖子，将操作1)的灭菌凹玻片平稳摆置于保湿材料面上。3)琼脂培养基的熔化：取病原菌孢子萌发适用的三角瓶盛装的琼脂培养基加热熔化。4)培养基的80℃处置：预先将普通水浴锅加热恒温到80℃，将操作3)熔化的培养基放入该水浴锅中，平衡至80℃。5)移液枪无泡移液的处置：把操作4)平衡至80℃的培养基转入无菌工作台，把移液枪取液量调到25μl，将枪头伸入80℃的培养基中反复吸排培养基，直至排液操作不出现气泡现象。6)微载体的滴注：操作5)无气泡现象后，过量按下移液枪吸取培养基，移起枪头并靠贴在三角瓶瓶口壁上脱除枪头外部粘附的培养基，再转移并滴注25μl到凹玻片的凹穴底部，培养基液滴在凹穴内扩展平衡后，形成一个25μl的微小块，该微小块没有气泡、表面平整，成为测试使用的合格微载体；连贯操作直至凹玻片全部滴注完毕。2.将待测样品载入微载体将已配备的待检测的药物样品液及测试对照处理样品液，转至无菌工作台，用移液枪吸取样品液10μl，在枪头不触及微载体面的情况下点放于步骤1制备的合格微载体表面的中部，让其自动在微载体面上扩展分散，静置至观察不到药物样品液即成为载药微载体。3.滴入病原菌孢子无菌条件下，将已备好的病原菌孢子液充分悬浮均匀，用移液枪吸取孢子液1μl，在枪头不触及微载体面的情况下点放于步骤2配成的载药微载体的中部，让孢子液自然分散。4.孢子萌发培养步骤3操作完毕后，盖上保湿器具的盖子，保持器具平稳状态，转移到培养箱中恒温培养，直至空白对照处理的孢子充分萌发。5.结果观测从培养箱中取出步骤4的培养材料，打开保湿器具的盖子，将载着微载体的凹玻片置于显微镜下，观察和记录各个微载体上孢子的萌发情况；根据对照处理的数据，计算所测定药物对孢子萌发的抑制作用。本专利技术的优点：1)测试体系小型化：常规平板测定技术的基本测试单元是一套平皿，通常设置3个以上重复，则一个样品需要3套以上平皿，占用较多的培养器具、耗材及培养空间；本专利技术技术的基本测试单元是一块微载体，多穴凹玻片一片可装载多块微载体，一套平皿可容纳多片凹玻片，因而可在一套平皿内测试多个样品，可以实现测试体系小型化。2)检测样本微量化：常规平板测定技术的一个测试单元往往需要消耗样品液10000μl以上，而本专利技术技术的一个测试单元只消耗样品液10μl，用量微少。具体实施方案下面结合实施例对本专利技术作进一步描述。本专利技术是在琼脂培养基的微小块上载入药物样品及病原菌孢子进行抑制作用测试，因而把该微小块称为微载体。由于药物样品直接加载到该微载体的表面，因而技术上要求该表面相对平整。也由于药物很容易通过表面渗透扩散到微载体内部，存在样品液的稀释效应，制备的微载体越小稀释效应越小，技术上也要求制备的微载体的大小等同一样。在微载体上观察测试结果需要借助显微镜观察，微载体上存在气泡时显微镜无法正常观察，因此技术上要求制备的微载体不能存在气泡。符合这些技术要求的微载体才是本专利技术的合格微载体。采用移液枪定量吸取培养基进行了试制实践，发现了一些技术问题与技术障碍：①将热熔状态的琼脂培养基移放到平面器具(如平皿或载玻片)，要么平展成流水状，要么凝成球面状，得不到相对平整及统一形状的微载体。②采用常规的移液操作，移转热熔状态的琼脂培养基时，很容易在微载体上形成气泡。③培养基温度偏低时，吸取在枪头中的培养基容易凝固而排不出来，或者排出来后，很快凝固而来不及平展。④而在培养基温度偏高时操作，更容易在排出的琼脂培养基中形成气泡。⑤吸液操作枪头外壁粘附有较多的培养基液，并跟着枪头转移及释放，影响移液量的准确性。怎样解决这些技术问题，至今未见公开有相关的技术方案，因而制备合格的微载体就成了本专利技术的技术关键。经过反复摸索，找到了解决上述技术问题的方法，就是用移液枪采取适当的操作，吸取80℃的琼脂培养基25μl点注到凹玻片的凹穴内，冷凝制成微载体，具体操作方法如下。预先准备配套的保湿器具(如培养皿或塑料盒等)，器具内放置无菌状态的保湿材料(如湿润的吸水纸或纱布等)。将保湿器具放入无菌工作台，打开器具的盖子，将备好的灭菌凹玻片平稳地摆放在保湿材料面上。然后将三角瓶装盛的适合病原菌孢子萌发的琼脂培养基加热熔化，放入80℃的水浴锅内平衡至80℃；再将80℃的培养基转入无菌工作台；把移液枪的移液量调到25μl，将枪头伸入80℃的培养基中反复吸液/排液操作，并观察培养基液面的气泡冒出情况，反复吸/排操作直至不出现气泡现象，通常吸/排20次左右能达到平衡，此时，过量按下吸液量，轻轻移起枪头，靠贴在三角瓶瓶口壁上并稍作停留约1秒种，脱除枪头外部粘附的培养基，再转移到凹玻片凹穴，轻轻按枪排出25μl培养基于凹穴底部，培养基在穴内自然扩展并很快冷却凝固成一个表面平整的微小块；接着保持移液枪按下状态，返回转入80℃三角瓶培养基内，吸液和移出点注操作下一个培养基微小块，重复这样的操作，直到全部凹玻片的凹穴都移液制成培养基微小块，注意这个过程中途不能长时间停止操作，否则培养基在枪头凝固；一旦出现凝固，需要更换枪头，重新进行前面所述的排除气泡操作，再接着吸液注制下一个凹穴培养基微小块。注制完毕后检查，平整无气泡的微小块就是合格的微载体。制备好合格的微载体之后，就可以将药物载入微载体，具体方法是，将准备好的待检测药物样品及测试对照处理样品置入工作台，用移液枪吸取样品液10μl，轻轻点放于微载体表面中部，注意避免枪头碰触微载体面，实际操作技巧是，在枪头靠近微载体面时，轻轻按下移液枪，样品液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微载体检测抑制物的测定方法，其特征在于，利用凹玻片制备25μl的琼脂培养基微载体，在微载体上载入药物样品以及病原菌孢子，检测药物对孢子萌发的抑制作用，测定方法的步骤如下：/n1)制备合格的微载体/n①凹玻片的灭菌：将洁净的凹玻片进行高温灭菌后备用；/n②凹玻片的摆置：预先准备能容纳保湿材料和凹玻片的保湿器具，在无菌工作台上打开保湿器具的盖子，将操作①的灭菌凹玻片平稳摆置于保湿材料面上；/n③琼脂培养基的熔化：取病原菌孢子萌发适用的三角瓶装盛的琼脂培养基加热熔化；/n④培养基的80℃处置：预先将普通水浴锅加热恒温到80℃，将操作③熔化的培养基放入该水浴锅中，平衡至80℃；/n⑤移液枪无泡移液的处置：把操作④平衡至80℃的培养基转入无菌工作台，把移液枪取液量调到25μl，将枪头伸入80℃的培养基中反复吸排培养基，直至排液操作不出现气泡现象；/n⑥微载体的滴注：操作⑤无气泡现象后，过量按下移液枪吸取培养基，移起枪头并靠贴在三角瓶瓶口壁上脱除枪头外部粘附的培养基，再转移并滴注25μl到凹玻片的凹穴底部，培养基液滴在凹穴内扩展平衡后，形成一个25μl的微小块，该微小块没有气泡、表面平整，成为测试使用的合格微载体；连贯操作直至凹玻片全部滴注完毕；/n2)将待测样品载入微载体/n将已配备的待检测的药物样品液及测试对照处理样品液，转至无菌工作台，用移液枪吸取样品液10μl，在枪头不触及微载体面的情况下点放于步骤1)制备的合格微载体表面的中部，让其自动在微载体面上扩展分散，静置至观察不到药物样品液即成为载药微载体；/n3)滴入病原菌孢子/n无菌条件下，将已备好的病原菌孢子液充分悬浮均匀，用移液枪吸取孢子液1μl，在枪头不触及微载体面的情况下点放于步骤2)配成的载药微载体的中部，让孢子液自然分散；/n4)孢子萌发培养/n步骤3)操作完毕后，盖上保湿器具的盖子，保持器具平稳状态，转移到培养箱中恒温培养，直至空白对照处理的孢子充分萌发；/n5)结果观测/n从培养箱中取出步骤4)的培养材料，打开保湿器具的盖子，将载着微载体的凹玻片置于显微镜下，观察和记录各个微载体上孢子的萌发情况；根据对照处理的数据，计算所测定药物对孢子萌发的抑制作用。/n...

【技术特征摘要】
1.一种微载体检测抑制物的测定方法，其特征在于，利用凹玻片制备25μl的琼脂培养基微载体，在微载体上载入药物样品以及病原菌孢子，检测药物对孢子萌发的抑制作用，测定方法的步骤如下：
1)制备合格的微载体
①凹玻片的灭菌：将洁净的凹玻片进行高温灭菌后备用；
②凹玻片的摆置：预先准备能容纳保湿材料和凹玻片的保湿器具，在无菌工作台上打开保湿器具的盖子，将操作①的灭菌凹玻片平稳摆置于保湿材料面上；
③琼脂培养基的熔化：取病原菌孢子萌发适用的三角瓶装盛的琼脂培养基加热熔化；
④培养基的80℃处置：预先将普通水浴锅加热恒温到80℃，将操作③熔化的培养基放入该水浴锅中，平衡至80℃；
⑤移液枪无泡移液的处置：把操作④平衡至80℃的培养基转入无菌工作台，把移液枪取液量调到25μl，将枪头伸入80℃的培养基中反复吸排培养基，直至排液操作不出现气泡现象；
⑥微载体的滴注：操作⑤无气泡现象后，过量按下移液枪吸取培养基，移起枪头并靠贴在三角瓶瓶口壁上脱除枪头外部粘附的培养基，再转移并滴注25μl到凹玻片的凹穴底部，培养基液滴...

【专利技术属性】
技术研发人员：王忠文，张君成，张正淳，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45