胆红素代谢功能基因片段及改造的HepG2细胞制造技术

本发明专利技术公开了一种胆红素代谢功能基因片段及改造的HepG2细胞，其中胆红素代谢功能基因片段，由UGT1A1、GS、OATP1B1三种基因片段顺序构成。以该基因片段改造的HepG2细胞，UGT1A1蛋白表达提高了120倍，相对于正常肝细胞提高了15倍；OATP1B1蛋白表达提高了接近10倍，基本接近正常肝细胞水平；反应到胆红素代谢酶活性的提高了15倍；凝血因子Ⅴ分泌提高了70％；凝血因子Ⅹ分泌提高了10倍，达到正常肝细胞的五分之一。

【技术实现步骤摘要】
胆红素代谢功能基因片段及改造的HepG2细胞
本专利技术涉及基因工程领域，具体地指一种胆红素代谢功能基因片段及改造的HepG2细胞。
技术介绍
HepG2细胞是一种肝癌细胞。该细胞分泌多种血浆蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等。现有HepG2细胞用做血液净化时存在胆红素代谢，凝血分泌等缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有HepG2细胞的缺陷，提供一种胆红素代谢功能基因片段及改造的HepG2细胞。为实现上述目的，本专利技术首先提供了一种胆红素代谢功能基因片段，由UGT1A1、GS、OATP1B1三种基因片段顺序构成，其中，各基因所对应分泌的蛋白如下：UGT1A1为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1；GS为谷氨酰胺合成酶；OATP1B1为有机阴离子转运多肽1B1；所述胆红素代谢功能基因片段用于HepG2细胞基因改造。优选地，所述UGT1A1-GS-OATP1B1的序列如SEQNo.1所示。本专利技术还提供了一种胆红素代谢功能基因表达质粒，包含上述胆红素代谢功能基因片段。优选地，所述质粒还包括嘌呤霉素筛选压力基因片段，所述嘌呤霉素筛选压力基因片段连接于所述胆红素代谢功能基因片段的3’端。进一步优选地，所述质粒还包括启动子片段pTBSCH1，位于述胆红素代谢功能基因片段的5’端。更进一步优选地，所述质粒的序列如SEQNo.2所示。本专利技术还提供了一种包含胆红素代谢功能基因的HepG2细胞，包含上述功能片段，或利用上述质粒改造HepG2细胞后获得。本专利技术中改造HepG2细胞采用的质粒包含的功能基因为：pTBSCH1-UGT1A1-GS-OATP1B1-Puro，序列如SEQNo.2所示，由多基因顺序连而成，其中UGT1A1在HepG2细胞的胆红素代谢通路中表达量最低；GS为谷氨酰胺合成酶，与细胞控制氮代谢及能量代谢调节有关；通过全基因组测序分析，OATP1B1为跨膜转运蛋白家族的重要成员；Puro为嘌呤霉素筛选压力。通过基因工程改造获得了HepG2-a细胞，相对于未改造的HepG2细胞，UGT1A1蛋白表达提高了120倍，相对于正常肝细胞提高了15倍；OATP1B1蛋白表达提高了接近10倍，基本接近正常肝细胞水平；反应到胆红素代谢酶活性的提高了15倍；凝血因子Ⅴ分泌提高了70％；凝血因子Ⅹ分泌提高了10倍，达到正常肝细胞的五分之一。其中凝血因子V和凝血因子Ⅹ分泌量的提高是由前述改造使细胞功能的综合提升所带来的效果。从现有研究文献我们可以看到，没有证据显示针对UGT1A1、OATP1B1、GS的改造直接能获得本专利技术的结果。参考文献如下：InductionofHumanUGT1A1byBilirubinThroughAhRDependent[PathwayDrugMetabolismLetters,2008,2,231-237]AccurateidentificationofUDP-glucuronosyltransferase1A1(UGT1A1)inhibitorsusingUGT1A1-overexpressingHeLacells[Xenobiotica,EarlyOnline:1–9]InvitroUGT1A1inhibitionbytyrosinekinaseinhibitorsandassociationwithdrug-inducedhyperbilirubinemia[CancerChemotherapyandPharmacology，3August2018]Age-DependentOxidativeStressElevatesArginase1andUncoupledNitricOxideSynthesisinSkeletalMuscleofAgedMice[OxidativeMedicineandCellularLongevityolume2019,ArticleID1704650,9pages]UGT1A1mutationsandpsychoses:towardsunderstandingtherelationshipwithunconjugatedbilirubin[CNSSpectrums(2019),page1–3.CambridgeUniversityPress2019doi:10.1017/S1092852919001251]ClinicalImportanceofOATP1B1andOATP1B3inDrug-DrugInteractions[DrugMetab.Pharmacokinet.26(3):220227(2011).]CompleteOATP1B1andOATP1B3deficiencycauseshumanRotorsyndromebyinterruptingconjugatedbilirubinreuptakeintotheliver[TheJournalofClinicalInvestigationhttp://www.jci.orgVolume122Number2February2012]“InteractionofSulfonylureaswithLiverUptakeTransportersOATP1B1andOATP1B3[BasicClinPharmacolToxicol,2018Aug,123(2):147-154.]Encapsulationofglutaminesynthetaseinmouseerythrocytes:anewprocedureforammoniadethoxification.Biochem.CellBiol.86:469-476(2008).]PivotalroleofglutaminesynthetaseinammoniadetoxificationHepatology[Hepatology.2017Jan,65(1):281-293.]本专利技术的有益效果：所获得的HepG2-a细胞在胆红素代谢能力和关键凝血因子的分泌方面均有很大提升；HepG2-a为生物人工肝和肝组织工程构建提供新的种源细胞选择的可能。附图说明图1为本专利技术用于HepG2细胞改造的质粒结构图。图2为HepG2和HepG2-a细胞的胆红素降解率比较图。图3为HepG2和HepG2-a细胞梯度实验的胆红素降解率比较图。图4为HepG2和HepG2-a细胞多个细胞因子表达量比较图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步的详细描述。以下实施例中采用的试剂或产品，未标明出处的均为市售，不用于限制本专利技术。本专利技术中核心的功能基因片段由UGT1A1-GS-OATP1B1三个基因构成，各个基因为人源，公开序列可以在(NCBIGenBank)中查询到。本专利技术中合成质粒中的该基因片段序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胆红素代谢功能基因片段，由UGT1A1、GS、OATP1B1三种基因片段顺序构成，其中，各基因所对应分泌的蛋白如下：/nUGT1A1为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1；/nGS为谷氨酰胺合成酶；/nOATP1B1为有机阴离子转运多肽1B1；/n所述胆红素代谢功能基因片段用于HepG2细胞基因改造。/n

【技术特征摘要】
1.一种胆红素代谢功能基因片段，由UGT1A1、GS、OATP1B1三种基因片段顺序构成，其中，各基因所对应分泌的蛋白如下：
UGT1A1为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1；
GS为谷氨酰胺合成酶；
OATP1B1为有机阴离子转运多肽1B1；
所述胆红素代谢功能基因片段用于HepG2细胞基因改造。


2.一种胆红素代谢功能基因片段，其特征在于：所述UGT1A1-GS-OATP1B1的序列如SEQNo.1所示。


3.一种胆红素代谢功能基因表达质粒，包含权利要求1所述胆红素代谢功能基因片段。


4.根据权利要求3所述的胆红素代谢功能基因表达质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：丰明乾，望威，王柯，
申请(专利权)人：武汉仝干医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42