抗PD-1抗体及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种抗PD‑1抗体或其抗原结合片段，以及制备方法和用途。该抗PD‑1抗体或其抗原结合片段可以有效阻断PD‑1与配体的结合，且与人PD‑1结合的特异性强，亲和力高，体内实验也表明被非人动物良好耐受，并且无毒，显著抑制肿瘤的增长。

【技术实现步骤摘要】
抗PD-1抗体及其用途
本专利技术涉及抗PD-1抗体
，具体涉及抗PD-1抗体或其抗原结合片段，以及制备方法和用途。
技术介绍
癌症是目前人类死亡率最高的疾病之一。根据世界卫生组织的统计数据，2012年全球癌症发病和死亡病例数分别达到1400万和820万。在中国，新诊断的癌症病例为307万，死亡人数为220万。抗癌抗体的最新临床和商业成功已引起对基于抗体的治疗剂的极大兴趣。需要开发抗癌抗体以用于各种基于抗体的疗法中治疗癌症。PD-1（程序性细胞死亡蛋白1，也称为CD279），主要表达于T细胞及初级B细胞表面，PD-1的两个配体（PD-L1和PD-L2），广泛表达于抗原提呈细胞（APCs）等。PD-1与其受体的相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达，肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，表达的PD-L1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡，进而逃避免疫系统的攻击。抑制PD-1与其配体的结合，可以使肿瘤细胞暴露于免疫系统的杀伤视野，进而达到杀伤肿瘤组织及治疗癌症的作用。因此，本领域急需获得更多的抑制PD-1与其配体结合的技术，故本专利技术提供了一种新的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，将其用于癌症的治疗。
技术实现思路
本专利技术提供了一种特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段可以有效抑制PD-1与其配体的结合，且与人PD-1结合的特异性强，亲和力高，体内实验也表明被非人动物良好耐受，并且无毒，显著抑制肿瘤的增长。具体如下：本专利技术的第一方面，提供了一种抗PD-1抗体或其抗原结合片段，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，以及轻链可变区的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中，VHCDR1的氨基酸序列包含SEQIDNO：1或7所示，VHCDR2的氨基酸序列包含SEQIDNO：2或8所示，VHCDR3的氨基酸序列包含SEQIDNO：3所示，VLCDR1的氨基酸序列包含SEQIDNO：4所示，VLCDR2的氨基酸序列包含SEQIDNO：5所示，VLCDR3的氨基酸序列包含SEQIDNO：6所示。优选的，所述的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3，以及VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的氨基酸序列选自下列任一组：进一步优选的，所述的重链可变区的氨基酸序列包含SEQIDNO:13或与SEQIDNO:13具有80%以上同源性且保留与PD-1结合的能力。进一步优选的，所述的轻链可变区的氨基酸序列包含SEQIDNO:14或与SEQIDNO:14具有80%以上同源性且保留与PD-1结合的能力。优选的，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体或多克隆抗体。优选的，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段可以是单链抗体（scFv）、Fv抗体、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性单链抗体、线性抗体、单链抗体分子、由抗体片段形成的多特异性抗体，以及任何包含抗体结合域或同源的抗体结合域的多肽。其中，抗体结合域可以包括完整的重链和/或轻链CDR、完整的抗体的重链和/或轻链可变区、完整的全长重链和/或轻链、或者来自所述抗体的单个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。单链抗体包含一个重链可变区和一个轻链可变区。优选的，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段中还包含来自人IgG4抗体的恒定结构域。进一步优选包含CL、CH1、CH2和/或CH3结构域。优选的，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段特异性结合人、嵌合或非人动物PD-1。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段特异性结合人PD-1（例如SEQIDNO:12）、猴PD-1（例如SEQIDNO:10）或嵌合PD-1（例如SEQIDNO:11）。本专利技术的第二方面，提供了一种编码上述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的核酸。本专利技术的第三方面，提供了一种核酸，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含：（1）包含重链可变区的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区包含SEQIDNO:1、2和3的VHCDR1、2和3，并且其中所述重链可变区在与包含SEQIDNO:14中所示氨基酸序列的轻链可变区配对时结合PD-1；和/或，（2）包含轻链可变区的免疫球蛋白轻链或其片段，所述轻链可变区包含SEQIDNO:4、5和6的VLCDR1、2和3，并且其中所述轻链可变区在与包含SEQIDNOs:13中所示氨基酸序列的重链可变区配对时结合PD-1。本专利技术的第四方面，提供了一种包含本专利技术所述核酸的载体。优选的，所述的载体能够在体内或体外或离体条件下表达。进一步优选的，所述的表达载体在体内细胞中持续高水平表达。优选的，所述的表达载体为原核表达载体或慢病毒表达载体。进一步优选的，所述的原核表达载体为大肠杆菌系列。本专利技术的第五方面，提供了一种包含上述核酸或载体的细胞。优选的，所述的细胞可以是真核的或者原核的。更优选的，所述的细胞可以为酵母细胞、293细胞、CHO细胞、大肠杆菌等。本专利技术的第六方面，提供了一种产生上述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞。本专利技术的第七方面，提供了一种杂交瘤细胞的制备方法，所述的方法包括用人PD-1免疫非人动物获得，收集人PD-1免疫后非人动物的脾细胞，将收集的脾细胞与SP2/0细胞融合获得杂交瘤细胞。本专利技术的第八方面，提供了一种抗PD-1抗体或其抗原结合片段的制备方法，培养包含上述的核酸的细胞，获得抗PD-1抗体或其抗原结合片段。本专利技术的第九方面，提供了一种制备抗PD-1抗体或其抗原结合片段的方法，所述的方法包括蛋白免疫法或者DNA免疫法。优选的，所述的方法包括用人PD-1免疫非人动物获得。优选还包含收集人PD-1免疫后非人动物的脾细胞。优选还包含将收集的脾细胞与SP2/0细胞融合获得杂交瘤细胞。优选将杂交瘤细胞导入非人动物，以及收集非人动物腹水的步骤。优选的，所述的人PD-1可以为人PD-1蛋白（优选为SEQIDNO:12所示的氨基酸序列）或编码人PD-1蛋白的核苷酸序列（优选为cDNA序列，进一步优选为编码SEQIDNO:12所示氨基酸序列的核苷酸序列）。优选的，所述的人PD-1蛋白经His标记。优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选为啮齿类动物。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的非人动物为大鼠或小鼠。本专利技术的第十方面，提供了一种抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价结合的所述的抗体或其抗原结合片段。优选的，所述的治疗剂可以为化学合成药、抗生素或者各种生物药。本专利技术的第十一方面，提供了一种药物组合物，其包含本专利技术所述的抗体或其抗原结合片段，或所述的抗体-药物缀合物，以及药用载体。优选的，所述药用载体可以是一种也本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，以及轻链可变区的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中，VHCDR1的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1所示，VHCDR2的氨基酸序列包含SEQID NO：2所示，VHCDR3的氨基酸序列包含SEQ ID NO：3所示，VLCDR1的氨基酸序列包含SEQID NO：4所示，VLCDR2的氨基酸序列包含SEQ ID NO：5所示，VLCDR3的氨基酸序列包含SEQID NO：6所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，以及轻链可变区的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中，VHCDR1的氨基酸序列包含SEQIDNO：1所示，VHCDR2的氨基酸序列包含SEQIDNO：2所示，VHCDR3的氨基酸序列包含SEQIDNO：3所示，VLCDR1的氨基酸序列包含SEQIDNO：4所示，VLCDR2的氨基酸序列包含SEQIDNO：5所示，VLCDR3的氨基酸序列包含SEQIDNO：6所示。


2.根据权利要求1所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的重链可变区的氨基酸序列包含SEQIDNO:13所示，所述的轻链可变区的氨基酸序列包含SEQIDNO:14所示。


3.根据权利要求1所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段为单链抗体、Fv抗体、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性单链抗体、线性抗体或多特异性抗体。


4.根据权利要求1-3任一所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段特异性结合人PD-1。

【专利技术属性】
技术研发人员：杨毅，刘亚翠，杨放，陈云云，郭雅南，沈月雷，
申请(专利权)人：北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11