测定病毒滴度的酶免疫斑点法制造技术

技术编号:2601744 阅读:265 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
一种测定病毒滴度的酶免疫斑点法,它包括以下几个步骤:单层细胞准备,病毒稀释,感染细胞培养、固定、封闭,加入该病毒的特异性抗体,加酶标记的第二抗体,加酶底物、数分钟后有病变的部位即出现染色斑点,本方法通过引入酶免疫技术使微量板上出现的CPE部位形成特异的染色斑点,从而可用肉眼直接判定各孔是否出现CPE,免去显微镜下观察CPE造成的工作量增加,使结果客观、更直观,便于记录,快速,操作误差小,易于推广使用。(*该技术在2017年保护过期,可自由使用*)

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒滴度的测定方法,特别是酶免疫斑点法(EIS)测定病毒滴度。病毒学理论研究应用病毒学的研究及生产过程都涉及病毒量的测定,即病毒滴度的测定。以往和现行的测定方法主要有动物法、蚀斑法和细胞病变法,其中常用的是蚀斑法和细胞病变法,特别是细胞病变法(CPE),因其较蚀斑法简便,利于多份样品的测定,常在多批量的测定中采用。但是,CPE法是以显微镜下观察细胞病变为判定指标,并依此计算半数细胞感染剂量(TCID50);试验对操作者技术要求高,不同病毒造成的细胞病变有差异也有雷同,造成病变结果不易辩认。因此,试验结果受主观因素影响较大,操作误差大,另外,CPE工作量大,工作强度高,操作时间长。本专利技术的目的是提供一种病毒滴度的测定方法,该方法简便、快速、便于记录结果,操作误差小。为实现上述目的,本专利技术采取以下技术方案一种测定病毒滴度的酶免疫斑点法,它包括以下几个步骤(1)单层细胞准备,并向细胞培养板各孔中加入细胞悬液;(2)病毒稀释,并将稀释后不同浓度的病毒分别加到测定用的细胞培养板孔中;(3)感染细胞的培养;(4)将步骤(3)中的感染细胞固定、封闭;(5)加入该病毒的特异性抗体;(6)加酶标记的第二抗体;(7)加酶底物,数分钟后有病变的部位即出现染色斑点。上述测定步骤中,从细胞准备至感染细胞培养系常规技术方法,对绝大多数病毒均适用,在作具体病毒的测定中,仅需改变该病毒的特异性抗体即可,其余各培养、反应步骤中,温度控制在36-37℃之间,抗体反应时间控制在20分钟至60分钟(除酶与底物作用时间较短外,底物抗体反应在室温下进行)。本专利技术利用免疫反应的特异性和酶化学反应放大性特点,创造性地形成染色斑点,使显微镜下才能辩别出来的细胞病变以肉眼可见的形式表现出来,并且保证了这种表现方式的特异性(抗原-抗体特异性结合),以往的酶联免疫吸附试验(EIA)都以显色反应测定OD值来判定结果或观察液体的颜色变化,其抗原、抗体反应是在可溶解和分散的状态下进行的,底物显色也是在溶解于液体中再表现出来的,而EIS与EIA的不同在于前者的反应及表现都是在细胞病变部位发生的,是定位的,有形的,与酶免疫组织化学技术相比,EIS是在细胞培养板上直接检测染色斑点,是有重要区别的。本专利技术优点通过引入酶免疫技术使微量板上出现的CPE部位形成特异的染色斑点,从而可以用肉眼直接判定各孔是否出现CPE,免去显微镜下观察CPE造成的工作量增加,使结果客观、更直观,快速、便于记录,操作误差小。下面结合实施例对本专利技术作进一步说明实施例11、取培养3-5天,生长良好的FL细胞(长春生研所提供),用细胞消化液处理后,弃干消化液,将细胞于细胞培养液中(MEM培养基含5%小牛血清,青霉素、链霉素各1万u/ml,稀释成30-50×104/ml浓度。在96孔细胞培养板上每孔加细胞悬液100μl。2、取麻疹病毒(长春生物制品研究所(长47株)50批)在试管中稀释成10-4、10-5浓度,分别加入细胞培养板孔中,每个浓度加8孔,每孔100μ1,继续做细胞培养。3、培养板置于5%CO2培养箱中,37℃,8天,上述几个步骤可见计划免疫技术管理规程(卫生部1987年)。4、固定将培养8天的培养板弃其培养液,各孔加固定液(70%丙酮/PBS(磷酸盐缓冲液))150μl,置冰盒内15分钟,弃去固定液,通风处凉干,置-20℃备用或直接进行下一步。5、封闭各孔加稀释液(PBS/BT)〔即PBS(0.01M,PH7.2)+0.5%明胶及0.15%吐温-20(Tween-20)〕150μl,37℃,30分钟,再用洗液(PBS/T)〔PBS+0.05%吐温-20(Tween-20)〕洗3次。6、加抗麻疹病毒单克隆抗体(McAb)V17株,该抗体以PBS/GT稀释1∶3000,随后每孔加75μl,37℃,40分钟,洗6次(洗液同上。7、加抗鼠IgG-过氧化物酶标记物(Ab-E)(美国ZYmed公司产品)用时以PBS/GT稀释1∶3000,每孔加75μl置37℃,40分钟,洗6次(洗液同上)。加底物用10ml的底物稀释液(用1.0M柠檬酸将0.1M醋酸钠至PH5.5)加入200μlTMB(系Sigma公司产品,100mgTMB溶于20mlDmso中,分装成1ml/瓶,置-20℃备用)再加20%H2O22μl,混匀后每孔加75μl,室温下放置5-20分钟。结果判定白色背景下肉眼观察,出现兰色斑点为阳性,未加病毒细胞的对照孔不出现染色斑点,记录各孔情况见图片(附附图说明图1)。图1中两个“S”指两份样品,“-4,-5”指10-4和10-5两个稀释度,NO.V.Contr指没有病毒的对照,即没有感染病毒的细胞经处理后不出现染色斑点,阴性对照。病毒滴度计算(Karber法)计算半数细胞感染浓度(TCID50),用其对数表示病毒滴定,LogTCID50=Xm+d(50-&Sigma;pi100)]]>Xm=病毒最高浓度的对数d=稀释倍数对数ΣPi=每个稀释度出现病变(斑点)孔数占同稀释度所用孔数的百分数,在公式中,Xm=-4,d=1,Pi计算时分母为8,如10-4浓度下有6孔出现斑点,则P-4=6/8×100%=75%,即10-4浓度下有75%孔出现斑点。结果1、试验的50批病毒滴度(TCID50/ml),最低的小于4.5,最高的6.5,分布见表1,50批病毒滴度与CPE法相比较,49份相符,符合率98.0%(49/50),其中一份病毒滴度不一致,EIS法滴度为6.50,CPE法是6.375。2、50批病毒滴度共用800个试验孔,各孔结果(+/-)总符合率为99.88%(799/800)。所有阴性对照孔未出现斑点。3、以800个试验孔结果(+/-)计算特异性,按下述方式计算真阳性数 假阴性数5100 510假阳性数 真阴性数本试验1289290总数 800敏感性=510/510×100%=100%特异性=289/290×100%=99.66%表150批麻疹病毒EIS法滴度分布 </tables>权利要求1.一种测定病毒滴度的酶免疫斑点法,其特征在于它包括以下几个步骤(1)单层细胞准备,并向细胞培养板各孔中加入细胞悬液;(2)病毒稀释,并将稀释后不同浓度的病毒分别加到测定用的细胞培养板孔中;(3)感染细胞的培养;(4)将步骤(3)中的感染细胞固定、封闭;(5)加入该病毒的特异性抗体;(6)加酶标记的第二抗体;(7)加酶底物,数分钟后有病变的部位即出现染色斑点。2.根据权利要求1所述的测定病毒滴度的酶免疫斑点法,其特征在于所述的病毒为麻疹病毒,特异性抗体为抗麻疹病毒单克隆抗体,酶标记的第二抗体为抗鼠IgG一过氧化物酶标记物。3.根据权利要求2所述的测定病毒滴度的酶免疫斑点法,其特征在于所述的抗麻疹病毒单克隆抗体以PBS/GT稀释,加至封闭后的感染细胞上,温度控制在36-37℃。4.根据权利要求2所述的测定病毒滴度的酶免疫斑点法,其特征在于所述的抗体反应时间控制在20-60分钟,温度37℃。5.根据权利要求1所述的测定病毒滴度酶免疫斑点法,其特征在于所述的加入酶标记物以PBS/GT稀释,温度控制在36-37℃。6.根据权利要求1所述的测定病毒滴度酶免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定病毒滴度的酶免疫斑点法,其特征在于:它包括以下几个步骤:(1)单层细胞准备,并向细胞培养板各孔中加入细胞悬液;(2)病毒稀释,并将稀释后不同浓度的病毒分别加到测定用的细胞培养板孔中;(3)感染细胞的培养;(4)将步骤 (3)中的感染细胞固定、封闭;(5)加入该病毒的特异性抗体;(6)加酶标记的第二抗体;(7)加酶底物,数分钟后有病变的部位即出现染色斑点。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:吕长国马沈英吴燕平扈光伟李守帮薄平宋洁槐
申请(专利权)人:吉林省卫生防疫站
类型:发明
国别省市:22[中国|吉林]

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